Vitamin A a vitamin E
Stanovení vitaminu A a vitaminu E v krmivech metodou HPLC
Stanovení vitaminu E v margarinu a tucích přímou extrakcí metodou HPLC
Zkušební vzorek se zmýdelní alkalickým hydroxidem (hydroxid draselný) ve zmýdelňovací aparatuře pod proudem dusíku za přítomnosti antioxidantů. Vitamin A a vitamin E se extrahuje do organického rozpouštědla (hexanu). Extrakt se odpaří k suchu na rotačním vakuovém odpařováku a odparek se rozpustí v methanolu, je-li nutné, naředí se na požadovanou koncentraci. Obsah vitaminu A se stanoví HPLC metodou s UV detekcí při vlnové délce 325 nm nebo fluorescenční detekcí při vlnových délkách (excitační vlnová délka 325 nm, emisní vlnová délka 480 nm). Separační podmínky (průtok mobilní fáze a eluční síla mobilní fáze) se nastaví takové, aby nedocházelo dělení cis a trans isomerů vitaminu A. Obsah vitaminu E se stanoví HPLC metodou s UV detekcí při vlnové délce 292 nm nebo fluorescenční detekcí při vlnových délkách (excitační vlnová délka 295 nm, emisní vlnová délka 330 nm). V případě použití programovatelného UV detektoru se zjišťuje obsah vitaminu A i vitaminu E v jediném nástřiku. Separace vitaminu A a vitaminu E s UV detekcí je ukázána na chromatogramu. Fluorescenční detekce je daleko citlivější, zejména u tokoferolu – separace retinolu a tokoferolu s fluorescenční detekcí.
Správná koncentrace standardu vitaminu A a vitaminu E se zjišťuje spektrofotometricky na základě jejich extinkčního koeficientu.
Roztoky vitaminu A a vitaminu E (a rovněž všechny operace) je nutné chránit před přímým slunečním světlem.
Stabilita roztoku vitaminu A a vitaminu E byla testována a byl sledován úbytek obsahu v závislosti na čase.
Při extrakci lipofilních vitaminů technikou kapalina-kapalina do hexanu je nutné přesně dodržet experimentální podmínky extrakce.
Tokoferoly se extrahují přímo hexanem za přítomnosti bezvodého síranu hořečnatého k odstranění vody. Tokoferoly jsou separovány na normální fázi (silikagel) s fluorescenční detekcí.
Tokoferoly se extrahují rozpuštěním tuku v hexanu (obsahující 0,1 % BHT) na ultrazvuku. Po rozpuštění tuku se přidá bezvodý síran hořečnatý a nechá se stát 2 hodiny. Po filtraci a převedení extraktu do definovaného objemu a naředění se tokoferoly separují za následujících chromatografických podmínek:
kolona: LiChrosorb Si 60, 5 mm, 250 x 4,6 mm, teplota okolí
mobilní fáze: 0,9 % isopropanolu v hexanu
průtok mobilní fáze: 0,9 ml/min
objem nástřiku: 20 ml
detekce: fluorescenční Ex.: 290 nm, Em.: 330 nm
LIteratura
