Vitamin D₂ a vitamin D₃

 

Skupina vitaminu D zahrnuje dva vitaminy - ergokalciferol (D₂) a cholekalciferol (D₃). Provitaminy jsou pak ergosterol (provitamin D₂) a 7-dehydrocholesterol (provitamin D₃).

Stanovení vitaminu D v krmivech

Problematika stanovení vitaminu D zahrnuje:

1.       nízký obsah vitaminu D₂ a D₃ a převažující obsah ostatních přítomných látek (tabulka 1)

2.       nízký molární extinkční koeficient vitaminu D a spektrální interference na koloně

3.       chemicky labilní (rovnováhy mezi formami vitaminu D – tabulka 2) – nelze určit obsah vitaminu D pouhým součtem forem vitaminu D - nutnost chránit vitamin D (antioxidanty, umělé osvětlení)

4.       nutnost separace od ostatních přítomných látek (steroly, karotenoidy, vitaminy)

 

K separaci vitaminu D se používá off-line dvourozměrná HPLC:

Semipreparativní kolona	Analytická kolona
Normální fáze (silikagel)	Reverzní fáze (C18)
Reverzní fáze (C18)	Normální fáze (silikagel)

 

nebo techniku switching column (přepínání kolon; např. HC ODS/PAH 250x2,6 mm / LC-18, 150x4,6 mm za použití mobilní fáze acetonitrl – methanol – voda (74+18+8) s UV detekcí 255 nm[1].)

Při technice off-line dvourozměrné HPLC se při použití silikagelu jako semipreparativní kolony používá mobilní fáze hexan – isopropylalkohol (99+1) v isokratickém módu[2],[3]  nebo gradientová eluce.

K separaci vitaminu D₂ a D₃ na reverzní fázi se používá mobilní fáze:

methanol – acetonitril (1+1) nebo methanol – tetrahydrofuran – voda (93+2+5)2, methanol – tetrahydrofuran (99+1)[4], acetonitril – dichlormethan – methanol (700+300+2)[5], acetonitril – methanol (90+10)[6].

K separaci vitaminu D₃ na normální fázi (silikagel) se používá mobilní fáze:

hexan – isopropanol (99,4 + 0,6)[7], hexan – amylalkohol (100 + 0,15)[8].

 

Separace vitaminu D₂ a D₃ na analytické koloně po předchozí separaci na semipreparativní koloně Silica je na ukázkovém chromatogramu.

Validační parametry metody stanovení vitaminu D₃ v premixech doplňkových látek jsou uvedeny zde.

Tabulka č. 1 Relativní poměr vitaminu D k ostatním přítomným látkám

 

Matrice	Relativní hmotnostní poměr k vitaminu D
	Vitamin A	Vitamin E	Cholesterol
surové mléko	1 500	5 000	600 000
hovězí játra	6 000	1 400	300 000
celé vejce	75	500	80 000

 

Tabulka č. 2  Rovnováha mezi cholekalciferolem a prekalciferolem

 

Teplota (oC)	Rovnovážná frakce (% )		Čas potřebný k dosažení dané  rovnováhy
	prekalciferol	cholekalciferol
-20	2	98	16 let
0	4	96	350 dní
20	7	93	30 dní
30	9	91	10 dní
40	11	89	3,5 dne
50	13	87	1,3 dne
60	16	84	0,5 dne
80	22	78	0,1 den
100	28	72	30 min

 

 

Literatura