metody stanovení ve vodě rozpustných VITAMINů
Vitamin B1 (Thiamin)
Vitamin B2 (Riboflavin)
Vitamin B6 (Pyridoxamin)
Vitamin C (Kyselina askorbová)
Vitamin H (Biotin)
Vitamin B5 (Kyselina pantothenová)
Kyselina nikotinová a nikotinamid
Vitamin B1 (Thiamin)
Thiamin je vázán většinou na koenzym karboxylásy (kyselina thiamindifosforečná), dále byla prokázána přítomnost kyseliny thiamintrifosforečné a lipothiaminu (konjugát thiaminu a kyseliny 6,8-thioktové), proto se musí uvolnit z těchto vazeb enzymatickou hydrolýzou, nejčastěji takadiastázou. Při použití enzymatické hydrolýzy se vzorek nejprve hydrolyzuje kyselinami (nejčastěji v autoklávu) - 0,1 M kyselinou chlorovodíkovou,[1] 0,1 M kyselinou sírovou [2],[3] při teplotě 100 až 120 oC po dobu 30 minut. Po ochlazení na laboratorní teplotu a úpravě pH na pH 4-5 se vázaný thiamin hydrolyzuje takadiastázou nebo b-amylásou[4] při teplotě 37 oC po dobu 16 hodin1 nebo při teplotě 45 - 50 oC po dobu 3 hodin2,4 až 15 hodin.3
Stanovení thiaminu je většinou založeno na oxidaci thiaminu v alkalickém prostředí mírnými oxidačními činidly – hexakyanoželezitanem draselným – za vzniku thiochromu. Dojde k uzavření kruhu mezi pyrimidinem a thiazolem přes methylenový můstek a aminoskupinu. Thiochrom je žlutá krystalická látka s teplotou tání 220-230 oC, rozpustná ve vodě, methanolu a ethanolu na silně modře fluoreskující roztoky. Má alkalický charakter, lze ji vytřepat do butanolu nebo pentanolu.
Vzhledem k nízkým obsahům thiaminu v krmivech a nízkému molárnímu absorpčnímu koeficientu thiaminu, nemůže být použita UV detekce. Proto také bylo publikováno poměrně málo HPLC metod stanovení, které jsou většinou založeny na předkolonové[5] nebo postkolonové [6],[7] derivatizaci thiaminu oxidací hexakyanoželezitanem draselným nebo chloridem rtuťnatým[8] v alkalickém prostředí na thiochrom. Thiochrom se detekuje při 418 nm až 435 nm o excitační vlnové délce 366 nm. K separaci thiaminu se používá jak polární tak i nepolární fáze. Při separaci na polární fázi (silikagelu) je vzhledem k polaritě thiaminu kapacitní faktor k = 19 i při použití mobilní fáze chloroform-methanol (90:10).[9] Při separaci na nepolární fázi se používají mobilní fáze s přídavky pufrů[10] nebo iontová párová chromatografie za použití hexansulfonové kyseliny.4
Riboflavin je vázán esterickou vazbou na kyselinu fosforečnou ve formě koenzymu flavinadenindinukleotidu a flavinmononukleotidu (FMN; riboflavin – 5´– fosfát), které jsou vázané na svůj specifický bílkovinný nosič (apoenzym) a nejčastěji vystupují ve formě barevné bílkoviny, žlutého flavoproteinu. K uvolnění vázaného riboflavinu na bílkovinu se používá hydrolýzy zředěných minerálních kyselin (HCl, H2SO4) [11],[12] a je popsána jako dostačující. 10,[13] Kromě kyselé hydrolýzy se používá enzymatická hydrolýza, která je nezbytná k uvolnění riboflavinu esterické vazby s kyselinou fosforečnou a používá se takadiastáza, [14],[15] trypsin[16] nebo clarasa.[17] Byla rovněž publikována metoda, ve které byla porovnávána enzymatická hydrolýza takadiastázou a kyselá hydrolýza 0,1M-HCl na čistém preparátu flavinadenindinukleotidu. Kyselá hydrolýza probíhala při teplotě 70 oC, enzymatická při teplotě 38 oC a pH 5,2 po dobu 2 hodin. FAD byl zhydrolyzován enzymatickou hydrolýzou z 90 % a kyselou hydrolýzou ze 45 %.[18] Při analýze celkového obsahu riboflavinu v krmivech nebo potravinách by neměla být enzymatická hydrolýza nikdy opomenuta.
Vzhledem k chemickým vlastnostem riboflavinu se příliš neliší separační podmínky na reverzní fázi C8 nebo C18 co do složení a pH mobilní fáze a rozdíly jsou minimální. Protože je riboflavin v alkalickém prostředí nestabilní a rozkládá se, pH mobilní fáze se upravuje pufry[19] nebo kyselinou octovou[20] resp. fosforečnou na hodnoty pH 3-6 nebo se používá iontové párové chromatografie s přídavky pentan-, hexan-[21] a heptansulfonové kyseliny[22] jako iontový reagent o koncentraci 0,005 mol/l. Ve finálních krmivech a potravinách se používá specifická fluorimetrické detekce s excitační vlnovou délkou 440-460 nm a emisní vlnovou délkou 520-535 nm. Detekční limit fluorimetrické detekce je 50 pg.
Kvantifikace vitaminu B6 v krmivech je komplikována výskytem tohoto vitaminu ve velmi nízké koncentraci v šesti rozdílných formách pyridoxinu. Kromě základní triády pyridoxinu je přítomen vitamin B6 ve vázané formě jejich esterů 5´-fosfátu. Všechny fosfáty jsou stabilní v alkalickém prostředí, ale v kyselém prostředí se snadno hydrolyzují. Použitím kyseliny chlorovodíkové a sírové jako extrakčního činidla za vysokého tlaku (v autoklávu) je vhodné pouze ke stanovení triády pyridoxinu.[23] K extrakci všech forem vitamerů B6 se používá kyselina chloristá[24] nebo sulfosalicylová. [25],[26] Nevýhodou kyseliny sulfosalicylové je nízká hodnota výtěžnosti a interference při stanovení s fluorescenční detekcí. Použití enzymatické hydrolýzy vede rovněž ke zvýšení obsahu vitameru B6 při jejich stanovení v přírodním materiálu.[27]
K separaci vitamerů B6 byla použita iontová chromatografie. Nevýhodou této techniky je použití gradientu pH mobilní fáze, která je pro rutinní analýzu málo reprodukovatelná, vysoká koncentrace pufrů (0,4 M chlorid sodný[28], 0,5 M fosfátové pufry[29]) - dochází ke krystalizaci těchto pufrů v systému, kapacitní faktory vitamerů jsou příliš vysoké (k>>10). [30],[31] Všechny tyto nevýhody byly odstraněny použitím reverzní fáze nebo iontové párové chromatografie. Jako protion při iontové párové chromatografie se používá hexansulfonová kyselina24,25 a za těchto podmínek jsou separovány všechny vitamery B6 za použití binárního gradientu. Použití reverzní fáze za použití pufrů nedovoluje separaci 5´-fosfátů od jejich mateřských sloučenin. Jako pufry se používají fosfátové pufry pH 2,2 ve směsi s acetonitrilem. [32],[33] Separace všech tří základních vitamerů B6 je ukázána na obrázku.
Protože je kyselina askorbová (AA) velmi nestabilní, podmínky extrakce jsou velmi důležité při všech typech stanovení. Kyselina askorbová se rozkládá za zvýšené teploty, přítomnosti kyslíku a rozklad katalyzují i přítomné kovy (zejména měď). Kyselina askorbová se při extrakci stabilizuje zajištěním nízkého pH, přítomností komplexotvorných látek a redukujících látek. Těmto podmínkám vyhovuje kyselina šťavelová, která v extraktu udržuje nízké pH a má i slabé komplexotvorné vlastnosti. Přítomnost vzdušného kyslíku se eliminuje probubláváním extraktu dusíkem a krátkým extrakčním časem. K omezení vlivu přítomných těžkých kovů se používá EDTA nebo se extrahuje kyselina askorbová do organických rozpouštědel. V žádném případě se nedoporučuje používat vyšších teplot při extrakci kyseliny askorbové, neboť za těchto podmínek dochází k rychlému rozkladu.[34] Z dalších extrakčních roztoků a stabilizátorů je možné jmenovat zředěnou kyselinou chloristou,[35] kyselina fosforečná za přítomnosti EDTA a siřičitanu sodného.[36]
Pro stanovení kyseliny askorbové i kyselina dehydroaskorbové (DHAA) byla publikována řada HPLC metod. Jako stacionární fáze byla často použita NH2 fáze, vzhledem k jejím vlastnostem slabého anexu,[37],[38] s použitím mobilní fáze acetonitril- 5 mM KH2PO4 (70+30) a přídavku 1,25 % merkaptoethanolu k potlačení oxidace kyseliny askorbové[39] nebo acetonitril-50 mM KH2PO4 (75+25). Reverzní fáze se používá k separaci kyseliny askorbové ve dvou módech - reverzní mód a iontové párové chromatografie. V reverzním módu se musí používat mobilní fáze o velmi nízkém pH k potlačení ionizace, ačkoli za těchto podmínek dochází k hydrolýze a rozpouštění silikagelu. [40],[41] Jako aditiva v iontové párové chromatografii se používají kvartérní amoniové soli nebo terciární aminy - hexadecyltrimethyl-1-amoniumbromid,[42] N-methyl-dodecylamin.[43]
Podle podmínek separace, zejména pH mobilní fáze, byla použita UV detekce při 254 nm resp. při 268 nm, ke zvýšení citlivosti a selektivity stanovení se používá reakce s o-fenylendiaminem za vzniku derivátu chinoxalinu a to u kyseliny dehydroaskorbové přímo a kyseliny askorbové po její oxidaci na kyselinu dehydroaskorbovou chloridem rtuťnatým.[44] Derivát chinoxalinu se detekuje při 430 nm s excitační vlnovou délkou 350 nm nebo při 425 nm s excitační vlnovou délkou 355 nm.[45]
Biotin je převážně vázaný na proteiny a tato vazby je relativně velmi stabilní. Proto jsou extrakční podmínky velmi drsné a vlastnímu stanovení biotinu v krmivech musí předcházet kyselá hydrolýza. Jako optimální byla popsána hydrolýza v 6 M HCl nebo 3M H2S04 při teplotě 120 oC po dobu 2 hodin v autoklávu.[46]
HPLC metoda, v důsledku nepřítomnosti chromoforu nebo fluoroforu v molekule biotinu, je omezena pouze na stanovení biotinu samotného nebo v premixech doplňkových látek. K separaci se používá reverzní fáze za použití mobilní fáze 0,01 M-KH2PO4-methanol (700+300) a UV detekce při 205-230 nm. [47],[48] Ke zvýšení selektivity a citlivosti biotinu a jeho derivátů byla použita předkolonová derivatizace, která zavádí do molekuly chromofor[49] nebo fluorofor. [50],[51] V poslední době byly popsány i metody postkolonové derivatizace biotinu. První z metod využívá nahrazení molekuly 2-(4´-hydroxyfenylazo)benzoové kyseliny z jejího komplexu s avidinem biotinem, které je sledováno při 345 nm.[52] Druhá metoda používá k postkolonové derivatizaci 2-anilinonaftalen-6-sulfonové kyseliny a fluorescenční detekci při 438 nm.[53]
Extrakce kyseliny pantothenové z jejích vazeb se uskutečňuje pomocí enzymatické hydrolýzy za použití papainu, clarásy, takadiastásy nebo přímo kyselinou chloristou.
Stanovení kyseliny pantothenové v krmivech a potravinách je poměrně obtížný úkol a existuje poměrně málo metod stanovení. HPLC metody stanovení kyseliny pantothenové v potravinách byly krátce diskutovány Polesellem a Rizzolem.[54]
Molekula kyseliny pantothenové neobsahuje žádný výrazný chromofor a bez derivatizace kyseliny pantothenové je UV nebo fluorecenční detekce velmi málo citlivá. Rovněž se nutné výrazně přečistit extrakt nebo použít přepínání kolon k odstranění všech interferentů. Tento způsob přečištění extraktu zvolil Iwase. Kyselina pantothenová je extrahována vodou při 50 °C, přidá se NaCl a extrakt se protřepe s n-hexanem. Vodná vrstva se použije přímo k HPLC analýze. Chromatografie zahrnuje v sobě předkolonovu on-line separaci na koloně Capcellpak C18 (150x4,6 mm) a analytickou kolonu Capcellpak C18 (250 x 4,6 mm). Jako mobilní fáze k předseparaci se používá acetonitril – voda, pH 2,1 (5+95) a poté se použije mobilní fáze acetonitril – voda, pH 2,1 (9+91) obsahující 1,5 mM 1-heptansulfonové kyseliny. Jako detekce se používá UV při 210 nm.[55]
Jako vhodnější metody stanovení kyseliny pantothenové se ukazují metody plynové chromatografie popřípadě metody GC-MS. Byla popsána metoda GC-MS stanovení kyseliny pantothenové v rýži a kvasnicích.[56]
Kyselina pantothenová se extrahuje vodou při 70 °C 30 minut a extrakt se přečistí na ionexu. K vyhodnocení se používá interní standard 5-[(2,4-dihydroxy-3,3-dimethyl-1-oxobutyl)amino]pentanová kyselina. Kyselou hydrolýzou kyseliny pantothenové vzniká pantolakton, který se po extrakci stanovuje plynovou chromatografií s plameno-ionizačním detektorem a k vyhodnocení se používá vnitřní standard ethyllaurát.
Kyselina nikotinová je relativně stabilní, kyselá i alkalická hydrolýza může být použita ke konverzi nikotinamidu na kyselinu nikotinovou, která se pak stanoví jako celkový obsah obou vitamerů.[57] Alkalická hydrolýza je doplňována enzymatickou hydrolýzou a k tomuto účelu se používá takadiastáza[58] papain nebo clarasa. Jako činidla k alkalické hydrolýze se používá hydroxid vápenatý[59],[60i] nebo hydroxid sodný,[61] přičemž se nikotinamid hydrolyzuje na kyselinu nikotinovou a obsah obou vitamerů se stanoví jako suma kyseliny nikotinové a nikotinamidu. Při použití hydroxidu vápenatého jako hydrolyzačního činidla se nadbytek činidla odstraňuje kyselinou šťavelovou, kdy se sráží málo rozpustný šťavelan vápenatý. Extrakt pak může být přečištěn technikou SPE, např. Za použití sorbentu C18 a iontoměniče spojených on-line.[60]
Při HPLC stanovení nikotinové kyseliny a nikotinamidu v potravinách a krmivech se uplatňují rozdílné chromatografické systémy, ale nejvíce se používá reverzní fáze, iontová párová chromatografie. Stanovení kyseliny nikotinové a nikotinamidu metodami HPLC bylo popsáno v cereáliích,[62] fortifikovaných potravinách[63] i krmivech.[64] Jako iontový pár se používá heptansulfonová kyselina,[65] dodecylsufonová kyselina[56] a tetrabutylamoniumhydroxid,[66] Pro separaci nikotinové kyseliny je vhodný jako iontový pár tetrabutylamoniumhydroxid a pro nikotinamid heptansulfonová kyselina. Za těchto podmínek dochází k separaci obou analytů na základní linii. Jako mobilní fáze se používá methanol – voda (1+9) s přídavkem 5 - 10 mM iontového páru. Detekční limit obou analytů je 10 mg/kg. Všechny uvedené metody používají k detekci UV detekci při 263 až 264 nm. Nejnovější způsob detekce niacinu je založen na Königově reakci niacinu s kyanidem. Při detekci se používá dvoustupňová postkolonová derivatizace chloraminem T a kyanidem draselným při 60 °C s UV detekcí při 410 nm.[67]
Chromatografické podmínky některých HPLC metod stanovení kyseliny nikotinové a nikotinamidu jsou uvedeny v tabulce.
HPLC metody stanovení kyseliny nikotinové a nikotinamidu
|
Analyt |
Matrice |
HPLC kolona |
Mobilní fáze |
Detekce |
Citace |
|
Nikotinamid |
krmivo |
A: RP-18 B: Nucleosil 5 SA |
A: 10 mM KH2PO4 B: 10 mM KH2PO4 - acenonitril (60+40), PŘEPÍNAČ KOLON; A: 0-17 min; B: 17-20 min |
UV 264 nm |
|
|
Celkový niacin jako kyselina nikotinová |
pšeničná mouka, sýr |
LC-18-DB |
acetonitril-voda obsahující 1 g H3PO4 a 1 g sodné soli dodecylsulfátu (23+77); 1,5 ml/min |
UV 254 nm |
62 |
|
Celkový niacin jako kyselina nikotinová |
džem |
Asahipak NH2P-50 |
acetonitril-75 mM octan sodný (60+40); 0,5 ml/min |
UV 261 nm |
61 |
|
Celkový niacin jako kyselina nikotinová |
potraviny |
PRP-X100 |
kyselina octová; 1,5 ml/min |
UV 254 nm |
[1] Hasselmann C., Franck D., Grimm P.A., Diop P.A., Soules C.: J. Micronutr. Anal. 5, 269 (1989)
[2] Mauro D.J., Wetzel D.L.: J. Chromatogr. 299, 281 (1984)
[3] Bognar A.: Fressenius´- J. Anal. Chem. 343, 155 (1992)
[4] Blanco D., Llaneza M.B., Gutierrez M.D.: J. Lig. Chromatogr. Relat. Technol. 19, 2155 (1996)
[5] Finglas P.M., Faulks R.M.: Food Chem. 15, 37 (1984)
[6] Hurst W.J., McKim J.M., Martin R.A.: Int. J. Vit. Nutr. Res. 53, 239 (1983)
[7] Vanderslice J.T., Huang M.-H.A.: J. Micronutr. Anal. 2, 189 (1986)
[8] Laschi-Loquerie A., Vallas S., Viollet J., Leclercq M., Fayol V.: Int. J. Vit. Nutr. Res. 62, 248 (1993)
[9] Ang C.Y., Mosely F.A.: J. Agr. Food Chem. 28, 483 (1980)
[10] Hasselmann C., Franck D., Grimm P.A., Diop P.A., Soules C.: J. Micronutr. Anal. 5, 269 (1989)
[11] Kodiček E., Wang Y.: Biochem. J. 44, 340 (1949)
[12] Scott M.L., Hill F.W., Norrest C., Heuser G.F.: J. Biol. Chem. 165, 65 (1946)
[13] Wimalasiri P., Wills R.B.H.: J. Chromatogr. 318, 412 (1985)
[14] Wegner M.J., Kemmerer A.R., Fraps G.S.: J. Biol. Chem. 146, 547 (1942)
[15] Scott M.L., Randall F.M., Hessel F.H.: J. Biol. Chem. 141, 325 (1941)
[16] Janicki J., Kaminski E.: Nahrung 2, 606 (1958)
[17] Wimalasiri P., Wills R.B.H.: J. Chromatogr. 318, 412 (1985)
[18] Knobloch E.: Intern. Z. Vitaminforschung 37, 38 (1967)
[19] Roughead Z.K., McCormick D.B.: J. Nutr. 120, 382 (1990)
[20] Johnsson H., Branzell C.: Int. J. Vit. Nutr. Res. 57, 53 (1987)
[21] Reyes E.S., Norris K.M., Taylor C., Potts D.: J. Assoc. Of. Anal. Chem. 71, 16 (1988)
[22] Jaumann G., Engelhardt H.: Chromatographia 20, 615 (1985)
[23] Bognar A.: Z. Lebensm. Unters. Forsch. 181, 200 (1985)
[24] Bitsch R., Möller J.: J. Chromatogr. 463, 207 (1989)
[25] Vanderslice J.T., Maire C.E., Doherty R.F., Beecher G.R.: J. Agric. Food Chem. 28, 1145 (1980)
[26] Gregory J.F., Feldstein D.: J. Agr. Food Chem. 33, 359 (1985)
[27] Kabir H., Leklem J., Miller L.T.: J. Food Sci. 48, 1422 (1983)
[28] Vanderslice J.T., Maire C.E.: J. Chromatogr. 196, 176 (1980)
[29] Coburn S.P., Mahuren J.D.: Methods Enzymol. 122, 102 (1986)
[30] Coburn S.P., Mahuren J.D.: Anal. Biochem. 129, 310 (1983)
[31] Vanderslice J.T., Maire C.E., Doherty R.F., Beecher G.R.: J. Agric. Food Chem. 28, 1145 (1980)
[32] Lim K.L., Young R.W., Driskell J.A.: J. Chromatogr. 188, 285 (1980)
[33] Gregory J.F.: J. Agr. Food Chem. 28, 486 (1980)
[34] Woggon H., Köhler V.: Mitt. Lebensmitt. Hyg. 54, 95 (1963)
[35] Veazey R.L., Nieman T.A.: J. Chromatogr. 200, 153 (1980)
[36] Mason W.D., Amick E.N., Heft W.: Anal. Lett. 13, 813 (1980)
[37] Sapers G.M., Douglas F.W., Ziolkowski M.A., Miller R.L., Hicks K.B.: J. Chromatogr. 503, 431 (1990)
[38] Tuan S., Wyatt J., Anglemier A.F.: J. Micronut. Anal. 3, 211 (1987)
[39] Margolis S.A., Black I.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70, 806 (1987)
[40] Van Boekel M.A., Meeuwissen C.A.: J. Chromatogr. 261, 176 (1983)
[41] Ziegler S.J., Meier B., Sticher O.: J. Chromatogr. 391, 419 (1987)
[42] Kneifel W., Sommer R.: Z. Lebensm. Unters. Forsch. 181, 107 (1985)
[43] Moll N., Joly J.P.: J. Chromatogr. 405, 347 (1987)
[44] Vanderslice J.T., Higgs D.J.: J. Micronutr. Anal. 7, 67 (1990)
[45] Hayashi H., Miyagawa A.: J. Food Hyg. Soc. Japan 31, 44 (1990)
[46] Thompson R.C., Eakin R.F., Williams R.J.: Science 94, 589 (1941)
[47] Chastain J.L., Bowers-Komro D.M., McCormick D.B.: J. Chromatogr. 330, 153 (1985)
[48] Hudson T.S., Subramanian S., Allen R.J.: J.Assoc. Off. Anal. Chem. 67, 994 (1984)
[49] Desbene P.L., Coustal L., Frappier F.: Anal. Biochem. 128, 359 (1983)
[50] Röder E., Engelbert U., Traschütz J.: Fresenius´ Z. Anal. Chem. 319, 426 (1984)
[51] Stein J., Hahn A., Lembcke B., Rehner G.: Anal. Biochem. 200, 89 (1992)
[52] Przyjazny A., Kjellström T.L., Bachas L.G.: Anal. Chem. 62, 2536 (1990)
[53] Przyjazny A., Bachas L.G.: Talanta 40, 1139 (1993)
[54] Polesello A., Rizzolo A.: J. Micronutr. Anal. 8, 105 (1990)
[55] Iwase H.: Anal.Sci. 9, 149 (1993).
[56] Banno K., Matsuoka M., Horimoto S., Kato J.: J. Chromatogr. 525, 255 (1990)
[57] Lambert W.E., De Leenheer A.: „Quantitative determination of water-soluble vitamins using HPLC“ v knize Food Analysis by HPLC, Marcel Dekker, New York, USA 1992.
[58] Vidal-Valverde A., Reche A.: J. Agric. Food Chem. 39, 116 (1991).
[59] Tyler T.A., Genzale J.A.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 73, 467 (1990).
[60] Ward C.M., Trennery V.C.: Food Chemistry 65, 667 (1997).
[61] Hirayama S., Maruyama M.: J. Chromatogr. 588, 171 (1991).
[62] Tyler T.A., Shrago R.R.: J. Liq. Chromatogr. 3, 269 (1980).
[63] Rees D.I.: J. Micronut. Anal. 5, 53 (1989).
[64] Balschukat D., Kress E.: J. Chromatogr. 502, 79 (1990)
[65] Takatsuki K., Suzuki S., Sato M., Sakai K., Ushizawa I.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70, 698 (1987).
[66] Trugo L.C., Macrae R., Trugo N.M.: J. Micronut. Anal. 1, 55 (1985).
[67] Stein J., Hahn A., Rehner G.: J. Chromatogr.B 665, 71 (1995).
[68] Balschukat D., Kress E.: J. Chromatogr. 502, 79 (1990).
[69] Chase G.W., Landen W.O., Soliman A.-G.M., Eitenmiller R.R.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 76, 390 (1993)
