Problematika stanovení lipofilních vitaminů v krmivech a potravinách metodou HPLC
Stanovení lipofilních vitaminů v krmivech a potravinách zahrnuje několik následných kroků - přípravu vzorku, alkalickou hydrolýzu vzorku, extrakci vitaminů z hydrolyzátu, přečištění extraktu a vlastní analytickou koncovku. Lipofilní vitaminy nejsou chemicky stabilní a dochází ke ztrátě jeho biologické aktivity, která je iniciována nebo katalyzována přítomností hydroperoxidů, vzduchem, světlem, vlhkostí, přítomností minerálních kyselin, těžkých kovů a dalšími oxidanty. Všechny tyto faktory jsou příčinou vysokých hodnot mezilaboratorní směrodatné odchylky stanovení těchto vitaminů v krmivech a potravinách.
Obsah
Standardy a stanovení koncentrace roztoku standardu vitaminu A
Příprava vzorku
Vzorky krmiv a potravin obsahující lipofilní vitaminy se musí chránit před přímým slunečním světlem, nadměrně vysokým teplotám a vlhkostí během transportu, skladování a přípravě vzorků v laboratoři.
Vitamin A je vzhledem ke své chemické labilitě dávkován ve formě želatinových kapslí. Distribuce těchto kapslí v krmivech a potravinách je velmi nerovnoměrná co do velikosti a počtu kapslí vitaminu A, současně může docházet ke shlukování částic při přípravě laboratorního vzorku[1] a proto se musí věnovat velká pozornost přípravě laboratorního vzorku. Při výpočtu minimální velikosti hmotnosti zkušebního vzorku již bylo vzato do úvahy, že velikost těchto částic není jednotná a rovněž obsah vitaminu A je v různých částicích různý. Byla vypočtena teoretická minimální relativní směrodatná odchylka pro různá krmiva, která činí 13 - 30 % pro navážku vzorku 40 g za podmínky, že chyba koncové analytické metody je nulová. Později se pokusil Bourgeois popsat jiný matematický model přípravy vzorku a jeho závěry byly podobné. Minimální směrodatná odchylka stoupá z 10 na 30 % rel. při poklesu hmotnosti zkušebního vzorku ze 100 g až na 10 g[2]. Závěrem lze proto konstatovat, že chyba přípravy vzorku závisí na velikosti hmotnosti navážky zkušebního vzorku, obsahu vitaminu A, druhu matrice a distribuci částic v daném materiálu. Se zvyšující se hmotností navážky zkušebního vzorku, obsahem vitaminu A, stejnorodostí co do velikosti částic a obsahu vitaminu A v nich, klesá chyba přípravy vzorku při stanovení vitaminu A. Vyjádříme-li chybu způsobenou přípravou vzorku (sp/X)2 v závislosti na průměrné hodnotě sledovaného znaku x, hmotnosti navážky vzorku mP a zrnitostí materiálu m, pak může psát[3]
|
|
K výše uvedeným skutečnostem je nutné zohlednit i velikost vzorku při odběru vzorku, která je vyšší než je obvyklé u ostatních vzorků. U velmi nehomogenních vzorků a vzorků o nestejné velikosti částic se musí vzorky homogenizovat před vlastní redukcí vzorku a redukce vzorku se musí provádět tak, aby byla vždy reprodukovatelná. U vzorků krmiv nebo potravin obsahující vysoký podíl tuku dochází při úpravě vzorku mletím nebo drcením k rychlému úbytku lipofilních vitaminů a tato úprava by měla být provedena bezprostředně před vlastní analýzou. Pokud je to možné, této úpravě se vyhýbáme a vzorky se upravují pouze jejich homogenizací a redukcí (vitaminové přípravky, premixy doplňkových látek a minerální krmiva)[4].
Vliv velikosti navážky na relativní směrodatnou odchylku stanovení vitaminu A metodou HPLC v krmivech je ukázán na obrázku. Je patrné, že zvýšením navážky z původních 15 g, které se používalo při teplé hydrolýze na 80 g při hydrolýze studené, dochází ke snížení směrodatné odchylky až na poloviční hodnoty. Vliv teplé a studené hydrolýzy na obsah lipofilních vitaminů byl studován dále.
Hydrolýza
Vitamin A nemůže být kvantitativně extrahován samotnými organickými rozpouštědly z fortifikovaných forem vitaminu A (kapsle), neboť obal kapsle musí být narušen vodou nebo alkalickými roztoky. To je jeden z důvodů použití alkalické hydrolýzy v analýze lipofilních vitaminů (vitamin A,E a D) v krmivech i potravinách[5]. Alkalická hydrolýza má ještě další důležité vlastnosti mimo uvolnění vitaminu A z kapslí. Estery všech forem vitaminu A a vitaminu E jsou přeměněny na alkoholická formu příslušného vitaminu), tuky (glyceridy a fosfolipidy) jsou hydrolyzovány na volné mastné kyseliny a glycerol, které mohou být separovány od vitaminů extrakcí organickými rozpouštědly. Velké množství přítomných přírodních barviv (xanthofilly, karotenoidy), antioxidanty a konzervanty jsou převáděny na ve vodě rozpustné frakce těchto látek. Vlastní hydrolýza vzorku se provádí ethanolickým roztokem hydroxidu draselného za přítomnosti antioxidantů pod zpětným chladičem po dobu nejméně 30 minut ve speciální zmýdelňovací aparatuře. Po celou dobu saponifikace se doporučuje probublávat celou aparaturu mírným proudem dusíku, který saturuje dané prostředí a preventivně chrání přítomné vitaminy před vzdušnou oxidací. Pokud se jedná o acetát a palmitát retinolu, ty jsou poněkud více stabilnější vůči oxidaci než samotný alkohol. Vitamin A je stabilní v přítomnosti alkálií, naopak extrémně citlivý je vůči kyselinám, které jsou promotorem jeho cis-trans isomerace.
U vitaminu D je nutno uvést rovněž přechod vitaminu D na příslušný previtamin, kdy dochází k ustavení rovnováhy mezi cholekalciferolem a prekalciferolem3, resp. ergokalciferolem a prekalciferolem2 vlivem isomerace. Isomerace vitaminu D na jeho previtamin je katalyzována zejména zvýšenou teplotou při alkalické hydrolýze.[6] Aktuální obsah vitaminu D v krmivu zůstává konstantní pouze v případě, že rovnováha mezi vitaminem D a prekalciferolem je ustálena a je-li teplota menší než 20 oC (tabulka), kdy rychlost isomerace je zanedbatelná. Během alkalické hydrolýzy dochází rovněž k isomeraci vitaminu A (je známo 5 biologicky aktivních geometrických isomerů), která je katalyzována přítomností minerálních složek v krmivu, zvýšenou teplotou a stupeň isomerace dosahuje až 40 %[7]. Proto se tento problém řeší studenou alkalickou hydrolýzou po dobu 12 až 16 hodin (přes noc) za laboratorní teploty[8].
Vliv teploty na rovnováhu mezi cholekalciferolem a prekalciferolem [9]
|
Teplota (oC) |
Rovnovážná frakce (% )
|
Čas potřebný k dosažení dané rovnováhy |
|
|
prekalciferol |
cholekalciferol |
||
|
-20 |
2 |
98 |
16 let |
|
0 |
4 |
96 |
350 dní |
|
20 |
7 |
93 |
30 dní |
|
30 |
9 |
91 |
10 dní |
|
40 |
11 |
89 |
3,5 dne |
|
50 |
13 |
87 |
1,3 dne |
|
60 |
16 |
84 |
0,5 dne |
|
80 |
22 |
78 |
0,1 den |
|
100 |
28 |
72 |
30 min |
Důležité je rychlé ochlazení hydrolyzátu po ukončení vlastní hydrolýzy. Množství hydroxidu draselného použitého k hydrolýze je závislé na množství tuku ve vzorku. Uvádí se, že na každý 1 g tuku je nutné použít 5 ml 60 % roztoku hydroxidu draselného a 15 ml ethanolu[10]. Jako další antioxidační činidla se používají např. samotný vitamin E (v krmivech je retinol a karotenoidy chráněny před oxidací přítomným nativním vitaminem E), pyrogallol[11], sodná sůl kyseliny askrobové11, butylhydroxytoluen[12]; sulfid sodný12se nepoužívá jako antioxidační činidlo, ale k vyvázání těžkých kovů ve formě nerozpustných sulfidů. Nevýhodou některých antioxidačních činidel (pyrogallol, butylhydroxytoluen) je, že při extrakci lipofilních vitaminů ze zmýdelněné matrice rovněž přechází do organické fáze[13] a může tak činit obtíže při vlastním stanovení vitaminů. Vliv teploty na obsah lipofilních vitaminů v krmivech při alkalické hydrolýze nebyl prokázán. V případě dodržení všech experimentálních podmínek jsou výsledky obsahů vitaminů A,E srovnatelné pro oba dva typy alkalické hydrolýzy (porovnání pro vitamin A, vitamin E).
Při přímé extrakci vitaminu D se používá jako extrakční činidlo dichlormethan obsahující fosforečnan sodný a butylhydroxytoluen[14] nebo 2-propanol/dichlormethan obsahující síran hořečnatý jako vysoušedlo a butylhydroxytoluen.[15] Při použití jednoduchých srceeningových metod stanovení vitaminu D v odstředěném mléce se mléko naředí vodou, ethanolem, přidá se vodný roztok amoniaku a vitamin D se extrahuje 4 hodiny organickým rozpouštědlem ether/hexan.Organická fáze po odpaření k suchu a převedení do příslušného rozpouštědla se jako koncovka ke stanovení vitaminu D používá HPLC metoda. Výhodou je, že se vzorek nemusí podrobit alkalické hydrolýze.[16]
Extrakce
Lipofilní vitaminy jsou extrahovány ze zmýdelněných vzorků krmiv a potravin různými rozpouštědly a samotná extrakce vitaminů je vůbec jeden z nejdražších, nejpracnějších kroků a zdrojem největších chyb při analýzách lipofilních vitaminů. Ke kvantitativní extrakci bylo vypracováno několik modelů k hledání optimálních poměrů při extrakci. Jako organická rozpouštědla se používají diethylether[17], petrolether[18], hexan, diisopropylether-petrolether[19] nebo 10 % ethylacetát v hexanu.[20] Účinnost extrakce hexanem vitaminu D z hydrolyzační směsi, zkoušena na modelových extrakčních podmínkách, je ovlivněna koncentrací ethanolu v hydrolyzátu pře vlastní extrakcí. Tyto studie ukazují, že nevýznamné množství vitaminu D je strháváno z hexanové fáze do ethanolové fáze při obsahu ethanolu pod 60 %. Vitamin A je snadno extrahován do hexanu z vodno-ethanolického roztoku s přídavkami vody, ale v případě vysokého obsahu tuku dochází k hydrolýze na soli mastných kyselin (mýdla) a poté se směs voda-ethanol-mýdlo chová jako uhlovodíkové rozpouštědlo, konkuruje tak vlastnímu organickému rozpouštědlu a snižování obsahu ethanolu (přídavkem vody) není již tak účinné. Účinnost extrakce hexanem, zkoušena na modelových extrakčních podmínkách, je ovlivněna koncentrací mastných kyselin v hydrolyzátu, jejich obsah proto musí být kontrolován. Výtěžnost extrakce vitaminu A je tedy limitována obsahem mastných kyselin (obsahu tuku ve vzorku) a koncentrací ethanolu v hydrolyzátu před vlastní extrakcí a toto je pravděpodobný důvod mnoha předcházejících neshod během analýz vitaminu A[21] mezi různými laboratořemi. Abychom dosáhly vysokých výtěžků vitaminu A ze zmýdelněné matrice do organického rozpouštědla, je nutné dodržet přesně koncentraci ethanolu ve vodné fázi mezi 30 a 40 %.[22],[23] Z pokusů je zřejmé, že výtěžnost extrakce vitaminu A i vitaminu E klesá se stoupajícím obsahem tuku v hydrolyzátu; se stoupajícím obsahem tuku je nutné zvýšit počet extrakčních kroků. Za přítomnosti mýdel protřepáváním organické a vodno-ethanolické fáze dochází ke vzniku emulzí, zejména za absence alkoholu a pak jsou promývací kroky nepříjemné[24], tvorba emulze se pak potlačuje přídavkem neutrálních solí (chlorid sodný) do reakčního prostředí. Z matematického modelu extrakčního procesu vyplývá, že malá výtěžnost vitaminu A a vitaminu E je způsobena malým přírůstkem objemu organického rozpouštědla v prvním kroku extrakce[25],[26].
Získané extrakty se většinou suší a stopové zbytky vody se odstraňují filtrací extraktu přes vrstvu bezvodého síranu sodného. Při zakoncentrování extraktu se používá destilace za sníženého tlaku, je nutné dbát, aby odparek byl vystaven minimální dobu působení vzduchu a ihned se rozpouští v definovaných rozpouštědlech. Je vhodné, aby se poslední zbytky extrakčního rozpouštědla odstranily pod proudem dusíku. Jestliže se při destilaci používá příliš vysokých teplot, může dojít k rozkladu lipofilních vitaminů a teplota by neměla přesáhnout 40 až 50 oC. Technika extrakce Extrelut byla použita při stanovení vitaminu A a vitaminu E v krmivech v roce 1985[27] a dále byla modifikována pro vzorky s vysokým obsahem tuku[28]. Výhodou této techniky je, že nedochází k tvorbě emulzí, výtěžek extrakce není ovlivněn obsahem tuku. Nevýhodou je, že není zcela dobře popsán mechanismus separace a není zajištěno reprezentativní složení sorbentu.
Přečištění organického extraktu
Přečištění extraktu zavádí do pracovního postupu krok navíc, který je možným zdrojem dalších chyb. Proto se, pokud toto není nezbytně nutné, dnes nepoužívá. Z možných postupů přečištění extraktu je možné zmínit srážení sterolů ze surového extraktu, extrakci kapalina-kapalina, tenkovrstevnou chromatografii a sloupcovou chromatografii. Srážení sterolů se provádí digitoninem v ethanolovém roztoku za studena za vzniku komplexu digitonin-sterol a následnou reextrakcí vitaminu[29]. Nejrozšířenějším čistícím krokem je použití sloupcové chromatografie, která má široké možnosti použití sorbentů - oxid hlinitý, silikagel a oxid hořečnatý a používá se většinou při spektrofotometrické koncovce stanovení vitaminu A. Dnes je vytlačována technikou SPE. Oxid hlinitý se používá aktivovaný při teplotě 600 oC a následně deaktivovaný 2 až 10 % vody. Oxid hlinitý musí být neutrální povahy, jeho kyselé i bazické vlastnosti musí být minimalizovány. Silikagelový sorbent se používá především v technice SPE.
Chromatografická separace
K separaci vitaminů (vitamin A, vitamin D a vitamin E) a se může použít jak separace na normální fázi tak separace na reverzní fázi. Výhodou HPLC metody je separace sledovaných vitaminů od dalších složek matrice, které jsou extrahovány do nepolárních rozpouštědel, a proto se nemusí používat přečištění surového extraktu.
Vitamin A
Separace na normální fázi - silikagelu - umožňuje separaci až šesti cis- trans - isomerů vitaminu A (11,13-di-cis-, 13-cis-, 11-cis-, 9,13-di-cis, 9-cis a all-trans-retinolu)[30]. Jako mobilní fáze se používá nepolární rozpouštědlo, nejčastěji hexan nebo cyklohexan, s přídavkem polárního solventu (2-propanol, ethanol). Separace isomerů vitaminu A na normální fázi silikagelu při použití mobilní fáze hexanu byla již optimalizována a k modifikaci mobilní fáze byly použity methylenchlorid, isopropylether a chloroform[31]. Silikagel jako sorbent neadsorbuje příliš silně glyceridy a mastné kyseliny a kolona může být po každé analýze promyta 25 % ethylacetátem v hexanu[32]. Problém deaktivace analytické kolony (sorbent silikagel) adsorpcí polárních látek z extraktu se může úspěšně vyřešit předřazením předkolony se stejným sorbentem jako analytická kolona. Byla popsána HPLC metoda stanovení vitaminu A v krmivech na normální fázi s použitím vnitřního standardu anthracenu[33] s fluorescenční detekcí (excitační vlnová délka 340 nm, emisní vlnová délka 460 nm). Jako mobilní fázi použili autoři hexan-dichlormethan-ethanol (90:9:1). Při separaci na reverzní fázi se používá jako stacionární fáze nejčastěji oktadecyl (C18) a různě modifikované mobilní fáze methanol/voda, acetonitril/voda. Separace na reverzní fázi má určitá omezení - nedochází k separaci cis-trans - isomerů vitaminu A, což v analytice krmiv není na závadu z důvodu hodnocení obsahu vitaminu A jako sumy obsahu obou isomerů vitaminu A. Výsledky mezilaboratorních porovnávacích zkoušek byly již publikovány[34]. K separaci vitaminu A byla použita reverzní fáze C18 s mobilní fází methanol/voda (970+30). Mezilaboratorní relativní směrodatná odchylka se pohybovala pro obsah vitaminu A v krmivech (6 000 m.j./kg až 48 000 m.j./kg) od 10 % do 30 % relativních, pro obsah vitaminu A v premixu 4 000 000 m.j./kg byla mezilaboratorní směrodatná odchylka 10 %.
Vitamin D
Stanovení vitaminu D představuje komplikovaný chromatografický problém, jehož podstata spočívá ve velmi nízkém obsahu tohoto vitaminu v premixech a tím spíše ve finálních krmivech (v premixech řádově 200 000 m.j./kg, ve finálních krmivech řádově 500 až 1000 m.j./kg, přičemž 1 m.j. odpovídá 0,025 mg vitaminu D2 což po přepočtu odpovídá 25 mg/kg ve finálním krmivu). Druhý problém stanovení vitaminu D v krmivech je nutnost separace vitaminu D od přítomných sterolů, karotenoidů, vitaminů a dalších přítomných látek, které jsou ve značném přebytku (tabulka). Proto se používají různé předseparační techniky - srážení sterolů digitoninem,[35] adsorpční kolonová chromatografie na oxidu hlinitém,[36] technika SPE na silikagelu[37] nebo reverzní fázi. Vlivem alkalické hydrolýzy dochází k isomeraci vitaminu D. Při separaci vitaminu D na normální i reverzní fázi dochází k separaci obou previtaminů od svých vitaminů,[38] ale na normální fázi nedochází k separaci vitaminu D2 a vitaminu D3. Pořadí separace previtaminů, vitaminů a provitaminů D na reverzní fázi C18 je následující: previtamin D2, vitamin D2, previtamin D3, vitamin D2, provitamin D2, provitamin D3.[39] K zamezení vlivu interference na analytické koloně, kdy byl identifikován jako interferující pík s největší pravděpodobností rozkladný produkt cholesterolu po alkalické hydrolýze, se používá detekce při vlnové délce 280 nm. Při této vlnové délce je hodnota absorbance vitaminu D 75 % maxima absorbance při 265 nm, ale při této vlnové délce však je spektrální interference potlačena na minimum.[40] Všechny výše uvedené problémy při analýze vitaminu D se řeší použitím off-line multidimensionální HPLC metodou, kdy se použije semipreparativní kolona s reverzní fází k frakcionaci vitaminu D. Frakce vitaminu D je podrobena dalšímu přečištění na silikagelu a následně po odpaření k suchu, rozpuštění v příslušném rozpouštědle, separaci a kvantifikaci na reverzní fázi.[41] Chromatogram separace vitaminu D2 a D3. Multidimensionální on-line HPLC metodu, která využívá předseparaci vitaminu D na normální fázi popsali jiní autoři.[42] Zajímavou off-line multidimensionální HPLC metodu stanovení vitaminu D popsal Agarwal.[43] Vitamin D po studené alkalické hydrolýze a extrakci do hexanu je isomerizován na svůj isotachysterol 10 M HCl v butanolu. Na semipreparativní koloně s reverzní fází C18 je sbírána frakce isotachysterolu vitaminu D a ta se následně separuje na analytické koloně na normální fázi (silikagelu) s UV detekcí při vlnové délce 301 nm.
Relativní poměr vitaminu D k ostatním přítomným látkám [44]
|
Matrice |
Relativní hmotnostní poměr k vitaminu D |
||
|
Vitamin A |
Vitamin E |
Cholesterol |
|
|
surové mléko |
1 500 |
5000 |
600 000 |
|
hovězí játra |
6 000 |
1 400 |
300 000 |
|
celé vejce |
75 |
500 |
80 000 |
Vitamin E
K separaci vitaminu E se může použít jak separace na normální fázi tak separace na reverzní fázi. Separace tokoferolů na reverzní fázi je limitována separací b a g tokoferolů, kdy nedochází k jejich separaci. Při separaci na normální fázi může být separováno až 9 tokoferolů a tokotrienolů v isokratickém módu hexan-tetrahydrofuran (99,5:0,5)[45],[46] nebo hexan-diethylether (95:5). Za běžných podmínek separace na normální fázi je pořadí separace následující: a-tokoferol, a-tokotrienol, b-tokoferol, g-tokoferol, b-tokotrienol, g-tokotrienol, d-tokoferol a d-tokotrienol. Na reverzní fázi se separují tokoferoly v pořadí: d-tokotrienol, (g+b)-tokotrienol, a-tokotrienol, d-tokoferol, (g+b)-tokoferol a a-tokoferol. Je zřejmé, že na reverzní fázi nedochází k separaci g- a b- tokoferolu a g- a b- tokotrienolu. Při stanovení celkového obsahu a-tokoferolu v krmivech se dává přednost reverzní fázi.[47],[48] Příklad chromatografické separace tokoferolů je uveden zde.
Detekce
K detekci vitaminu A mohou být použity všechny tři typy detekce v HPLC - spektrofotometrický, fluorescenční a elektrochemický detektor. Při spektrofotometrické detekci je absorpční maximum retinolu a jeho esterů 325 nm a mez detekce se pohybuje kolem 2 ng[49]. Většina lipidů mám maximum absorpce pod 220 nm, konjugované mastné kyseliny mají maximum absorpce 230-235 nm (dieny) a 260-280 nm (trieny)[50] a při stanovení (detekci) neruší. Glyceridy a steroly mají maximum absorpce při 265-266 nm, ale jejich absorpční koeficienty jsou poměrně nízké. Fluorescenční excitační spektra retinolu a jeho esterů korespondují s absorpčními spektry a maximum se pohybuje mezi 324-328 nm; emisní maximum se pohybuje od 470 do 490 nm[51] a detekční limit je 0,5 ng. Elektrochemická amperometrická detekce retinolu je méně selektivní než detekce spektrofotometrická, detekční limity jsou srovnatelné[52].
Absorpční maxima tokoferolů se pohybují od 292 do 298 nm a detekční limity se pohybují od 50 do 130 ng.[53] Fluorescenční detekce je ve srovnání se spektrofotometrickou detekcí citlivější a detekční limity jsou o jeden řád nižší. Excitační a emisní maximum volného alkoholu tokoferolu je 295 nm respektive 330 nm.[54] Fluorescenční výtěžky esterů analogů tokoferolů jsou velmi nízké a a-tokoferolacetát vykazuje 0,5 % hodnotu ve srovnání s a-tokoferolem. Tokoferol acetát vykazuje excitační a emisní maxima 285 nm resp. 310 nm.
K detekci vitaminu D se používá UV detekce při 264 nm, alternativou k UV detekci je detekce elektrochemická, amperometrická. Metoda flow-injection s elektrochemickou detekcí na uhlíkové elektrodě popisuje stanovení vitaminu D ve farmaceutických preparátech,[55] detekční limit je 7 ng vitaminu D3.
Standardy a stanovení koncentrace roztoku standardu vitaminu A
Standardy vitaminu A jsou jedním ze zdrojů chyb stanovení vitaminu A v krmivech a potravinách. Obsahy komerčně dodávaných standardů vitaminu A se pohybují od 50 % do 140 % rel. vzhledem k jejich aproximovaným hodnotám4. Proto se přesná koncentrace roztoku standardu vitaminu A musí stanovit po jeho zmýdelnění a extrakci do organického rozpouštědla spektrofotometricky s maximem mezi 324 nm až 327 nm. Koncentrace vitaminu A cA v m.j./g se vypočítá podle vzorce:
|
|
kde A absorbance roztoku vitaminu A, V je
objem extraktu v organickém rozpouštědle v l, m je
navážka standardu vitaminu A v g. Hodnoty 
jsou tabelovány (tabulka I)[56],[57]. Použití nesprávných tabelovaných hodnot může vést
k chybám při výpočtu koncentrace standardu vitaminu A. Při přepočtu obsahu
vitaminu A se vychází z definice mezinárodní jednotky, která je definována
jako 0,344 mg krystalického all-trans-retinol
acetátu a odpovídá právě 1 m.j. vitaminu A. 1 m.j. vitaminu A odpovídá
0,300 mg all-trans retinolu nebo 0,550 mg all-trans-retinol palmitátu. Při kalibraci
je doporučováno použít k sestrojení kalibrační přímky dvou nebo více
standardů vitaminu A od různých výrobců nebo používat na každý bod kalibrační
přímky samostatnou navážku standardu vitaminu A.
Literatura
[1]. Lehman R.W.: J. Assoc. Off. Agric. Chem. 43, 15 (1960).
[2]. Bourgeois C.F.: Analusis 12, 84 (1984).
[3]. Wilson D.: Analyst 89, 18 (1964).
[4]. Thiex N., Smallidge R., Beine R.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 79, 1269 (1996).
[5]. Coley M.L.: J. Agric. 37, 742 (1954).
[6] Hanewald K.H., Mulder F.J., Keuning K.J.: J. Pharm. Sci. 57, 1308 (1968)
[7]. Steuerle H.: Z. Lebensmittel.- Unters.-Forsch. 181, 400, (1985).
[8]. Thompson J.N., Maxwell W.B., Abbe M.L.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 60, 998 (1977).
[9] Mulder F.J., de Vries E.J. and Borsje B.: J.Assoc.Off.Anal.Chem. 54, 5, 1168 (1971)
[10]. Reynolds S.L.: Inst. Food. Sci. Technol. 18, 43 (1985).
[11]. DeVries J.W., Egberg D.C., Heroff J.C.: v knize: Liquid Chromatographic Analysis of Food and Beverages, strana 477, 2. díl, Academic Press, New York 1979.
[12]. VDLUFA (Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs und Forschungsanstalten), 2. vydání, kapitola 13.1.2., Methodenbuch Band III, 1988.
[13]. Taylor S.L., Lamden M.P., Tappel A.L.: Lipids 11, 530 (1976).
[14] Cohen H., Wakeford B.: J.Assoc.Off.Anal.Chem. 63, 1163 (1980)
[15] Landen W.O. : J.Assoc.Off.Anal.Chem. 68, 183 (1985)
[16] O´Keefe S.F., Murphy P.A.: J. Chromatogr. 445, 305 (1988)
[17]. Thompson J.N., Hatina G.: J.Liquid Chromatogr. 2, 237 (1979).
[18]. Reynolds S.L., Judd H.J.: Analyst 109, 489 (1984).
[19]. Indyk H.E.: Analyst 113, 1217 (1988).
[20]. Ueda T., Igarashi O.: J. Micronut. Anal. 3, 185 (1987).
[21]. Thompson J.N.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 69, 728 (1986).
[22]. Thompson J.N., Hatina G., Maxwell W.B., Duval S.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 65, 624 (1982).
[23]. Douša M.: Bulletin ´97 laboratorního odboru, ročník I, číslo 1/1997, ÚKZÚZ Brno 1997.
[24]. Mulder F.J.: Recl.Trav. Chim. Pays Bas 73, 626 (1954).
[25]. Pomeranz Y., Meloan C.E.: v knize: Food Analysis: Theory and Practice, strana 354, Avi Publishing, Westport, CT 1978.
[26]. Laitinen H.A., Harris W.E.: v knize: Chemical Analysis, 2. vydání, strana 426, McGraw-Hill Inc., New York 1975.
[27]. Bourgeois C.F.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 68, 1121 (1985).
[28]. Bourgeois C.F.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71, 12 (1988).
[29]. Green J.: Biochem. J. 49, 45 (1951).
[30]. Stancher B., Zonta F.: J. Chromatogr. 287, 353 (1984).
[31]. Landers G.M., Olson J.A.: J. Chromatogr. 291, 51 (1984).
[32]. Thompson J.N., Hatina G., Maxwell W.B., Surval S.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 63, 894 (1980).
[33]. Inno Y., Ono T.: Nippon-Chikusan-Gakkaiho 58, 813 (1987).
[34]. Analytical Methods Comittee, Analyst 110, 1019 (1985).
[35] Muniz J.F. , Wehr C.T., Wehr H.M.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 65, 791 (1982)
[36] Wickroski A.F., McLean L.A.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 67, 62 (1984)
[37] Indyk H., Woollard D.C.: J. Micronut. Anal. 1, 121 (1985)
[38] DeVries J.W., Zeeman J., Esser R.J.E., Borsje B., Mulder F.J.: J.Assoc.Off.Anal.Chem. 62, 129 (1989)
[39] Zonta F., Stancher B., Bielawny J.: J. Chromatogr. 246, 105 (1982)
[40] Indyk H., Woollard D.C.: N.Z.J. Dairy Sci. Technol. 20, 19 (1985)
[41] Takeuchi A., Okano T., Tsugama N., Katayama M., Mimura Y., Kobayashi T.: Micronut. Anal. 4, 193 (1988)
[42] Bekhof J.J., van den Bedem J.W.: Neth. Milk Dairy 42, 423 (1988)
[43] Agarwal V.K.: J.Assoc.Off.Anal.Chem. 72, 1007 (1989)
[44] Osborne D.R., Voogt P.: The Analysis of Nutrients in Foods, Academic Press, London 1978
[45] Cavins J.F., Inglett G.E.: Cereal Chem. 51, 605 (1974)
[46] Taylor P., Barnes P.: Chem. Ind. 20, 722 (1981)
[47] VDLUFA (Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs und Forschungsanstalten), Methodenbuch Band III, kapitola 13.5.4., 2.Erg. 1988
[48] Manz U., Philipp K.: Int. J. Vitam. Nutr.Res. 51, 342 (1981)
[49]. Bhat P.V., Sunderesan P.R.: CRC Crit. Rev. Anal. Chem. 20, 197 (1988).
[50]. Gunstone F.D., Norris F.A.: v knize: Lipids in Foods. Chemistry, Biochemistry and Technology, Pergamon Press, Oxford 1983.
[51]. Collins C.A., Chow C.K.: J. Chromatogr. 317, 349 (1984).
[52]. MacCrehan W.A., Schönberger E.: Clin. Chem. 33, 1585 (1987).
[53] Abe K., Yuguchi Y., Katsui G.: J. Nutr. Sci. Vitaminol 21, 183 (1975).
[54] Duggan D.E., Bowman R.L., Brodie B.B., Udenfriend S.: Archs Biochem. Biophys. 68, 1 (1957).
[55] Sanchez Perez A., Delgado Zamarreño M.M., Hernandez Mendez J., Sanchez Rodriguez M.: Anal. Chim. Acta 225, 247 (1989).
[56]. Gillingham J.T.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 50, 828 (1967).
[57]. Glick D.: J. Biol. Chem. 156, 643 (1944).