Stanovení - Vitaminy

Nejčastěji se používá při stanovení vitaminu K přímá extrakce různými organickými rozpouštědly - petrolether-diethylether (1:1) po předchozí srážení proteinů ethanolem,[1] dichlormethan-isooktan (2:1) po předchozím promícháním matrice s koncentrovaným roztokem hydroxidu amonného a methanolem,[2] nebo přímá extrakce roztokem chloroform-methanol (2:1).[3]

Pro přímou extrakci vitaminu K ₃ včetně sodné soli menadionsulfátu (MBS) v premixech a krmivech byl použit chloroform. MBS se po extrakci podrobí hydrolýze přídavkem koncentrovaného roztoku amoniaku, následně se přidá směs celitu a bezvodého síranu sodného k vysušení extraktu a nakonec se tato směs neutralizuje ledovou kyselinou octovou. K přímému stanovení vitaminu K se použije chloroformová vrstva .[4]^,[5] Druhý způsob extrakce využívá extrakci vodným roztokem methanolu. Po přídavku 5 % roztoku uhličitanu sodného, kterým se převede MBS na volný menadion, se menadion extrahuje hexanem. Hexanový extrakt se odpaří k suchu a rozpustí v methanolu.

K separaci vitaminu K se používá jak normální tak reverzní fáze, ale na normální fázi dochází k separaci cis- a trans-phylloquinonu od příslušných menaquinonů (MK-4 až MK-10). [6], [7] Metody pro stanovení vitaminu K v krmivech jsou sumarizovány v tabulce.

Pro velmi nízké hladiny vitaminu K byla použita velmi selektivní fluorimetrická detekce hydronaphtochinonu po předchozí redukci. K redukci vitaminu K se používají tři způsoby redukce - postkolonová derivatizace s kovovým zinkem,[11] redukce elektrochemická [12],[13] nebo fotochemická redukce.[14] Vitamin K₁ může být redukován na příslušný hydrochinon (K₁H₂) kovovým zinkem za přítomnosti iontů zinku:

Zinkový reduktor se zařazuje mezi analytickou kolonu a detektor (3,9x20 mm). Výtěžek redukované formy závisí na obsahu chloridu zinečnatého v mobilní fázi a pH mobilní fáze.

S úspěchem může být použita elektrochemická detekce, která je selektivnější proti UV detekci a rovněž mez stanovitelnosti je nižší. Mobilní fáze musí obsahovat určité množství vody nebo alkoholu ke zvýšení vodivosti mobilní fáze jako elektrolytu nebo neutrální soli - acetonitril-dichlormethan-25mM NaClO₄ (95:5:5). Jako pracovní elektroda k detekci byla použita argentchloridová elektroda při pracovním potenciálu - 1,1 V (proti SKE). ^[15]

[1] Manes J.D., Fluckiger H.B., Schneider D.L.: J. Agric. Food Chem. 20, 1130 (1972)

[2] Hwang S.-M.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 68, 684 (1985)

[3] Haroon Y., Shearer M.J., Rahim S., Gunn W.G., McEnery G., Barkhan P.: J. Nutr. 112, 1105 (1982)

[4] Manz U., Maurer R.: Intern. J. Vit. Nutr. 52, 248 (1982)

[5] White S.: Anal. Proc. 30, 266 (1993)

[6] Haroon Y., Shearer M.J., Barkhan P.: J. Chromatogr. 200, 293 (1980)

[7] Haroon Y., Shearer M.J., Barkhan P.: J. Chromatogr. 206, 333 (1981)

[8] Speek A.J., Schrijver J., Schreurs W.H.P.: J. Chromatogr. 301, 441 (1984).

[9] Laffi R., Marchetti S., Marchetti M.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71, 826 (1988).

[10] Billedeau S.M.: J. Chromatogr. 472, 371 (1989).

[11] Haroon Y., Bacon D.S., Sadowski J.A.: J. Chromatogr. 384, 383 (1987)

[12] Langenberg J.P., Tjaden U.R.: J. Chromatogr. 305, 61 (1984)

[13] Haroon Y., Schubert C.A.W., Hauschka P.V.: J. Chromatogr. Sci. 22, 89 (1984)

[14] Indyk H.: J. Micronutr. Anal. 4, 61 (1988)

[15] Schneiderman M.A., Sharma A.K., Mahanama K.R.R., Locke D.C.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71, 815 (1988)

Analyt	Matrice	Extrakce	Analytická HPLC	Citace
K₃	premixy a krmiva	CHCl₃, NH₄OH, celit-síran sodný	LiChrosorb Si 60 5 mm, 250x3,2 mm THF+hexan (5+95) nebo chloroform + hexan (4+96) UV 251 nm	[4]
K₃	premixy a krmiva	voda+ethanol (6+4), 10 % tanin, reextrakce do hexanu s přídavkem CaCO₃	ODS-Hypersil 5 mm , 250x4,6 mm Ethanol+voda (6+4) FL: Ex.:325, Em.: 425 nm po postkolonové redukci borohydridem sodným	[8]
K₃	premixy a krmiva	CHCl₃, NH₄OH, celit-síran sodný, neutralizace HOAc	LiChrosorb Si 60 5 mm, 250x4,0 mm CH₂Cl₂ (1,8 ml/min) UV 251 nm	[9]
K₃	premixy a krmiva	voda+methanol (6+4), 5 % uhličitan sodný, reextrakce do n-pentanu	Supelcosil LC-18, 5 mm, 250x4,0 mm methanol + voda (75+25) FL Ex.:325, Em.: 425 nm po postkolonové redukci	[10]
K₁, K₂, K₃	premixy a krmiva	CHCl₃, NH₄OH,, celit-síran sodný (3+10), neutralizace HOAc	LiChrosorb Si 60 5 mm, 250x4,0 mm hexan + CH₂Cl₂ (1,0 ml/min) UV 264 nm	[5]