Nifursol se používá jako chemoterapeutikum v krmivech pro krůty v dávce 50-75 mg/kg finálního krmiva k prevenci a terapii histomoniázy.
Ke stanovení nifursolu se používají jednak spektrofotometrické[1], polarografické[2], GC[3] a HPLC metody. Spektrofotometrické a polarografické metody jsou málo selektivní, GC metoda je naopak velmi citlivá i specifická, ale poměrně experimentálně náročná.
HPLC metody používají k extrakci jednak dimethylformamid[4], acetonitril[5] nebo tetrahydrofuran. Roztoky nifursolu jsou málo stabilní a na stabilitu roztoků nifursolu má vliv pH roztoku a rovněž jsou citlivé na světlo. K zamezení rozkladu nifursolu je možné použít butylhydroxytoluen a roztoky jsou pak stabilní až 24 hodin.[6] První HPLC metoda4 stanovení nifursolu v krmivech byla publikována v roce 1981. Nifursol je extrahován acetonitrilem při teplotě 70 °C po dobu 45 minut a k odstranění interferencí se používá sulfid uhličitý. Extrakt se analyzuje na chromatografické ionexové koloně (Zipax SAX) s UV detekcí při 365 nm. Jako mobilní fáze se používá 0,4 % vodný chloristan sodný – acetonitril (1+1). Výtěžnost metody se pohybuje pro obsahy od 25 do 100 mg/kg od 103,8 % do 98,1 % a směrodatná odchylka od 4,6 % do 2,8 %. Průměrná hodnota výtěžnosti je 100,6 % a směrodatná odchylka 3,5 %. V metodice sdružení Analytical Methods Committee5 je nifursol extrahován acetonitrilem v Soxhletově aparatuře po dobu 3 hodin s 12 cykly za hodinu. Takto připravený extrakt se odpaří za vakua asi na 1/3, potom se naředí mravenčanem amonným (pufr pH 3,5) a analyzuje se na chromatografické koloně C18 (m-Bondapak) s UV detekcí při 365 nm. Byla porovnána výtěžnost metody pro extrakci dimethylformamidem a acetonitrilem. Oba způsoby extrakce jsou srovnatelné, extrakce dimethylformamidem poskytuje poněkud nižší výsledky, u granulovaných krmiv extrakce dimethylformamidem poskytuje naopak vyšší výsledky. Bylo zjištěno, že granulací dochází zřejmě k rozkladu nifursolu nebo nedokonalé extrakci nifursolu vlivem jeho obdukce během granulace. Mezilaboratorní porovnávací zkoušky se zúčastnilo 7 laboratoří, průměrný výtěžek extrakce je 95 ± 14 % (P=0,95). Velmi specifická HPLC metoda stanovení nifursolu v premixech a krmných směsích byla publikována v roce 1994 (cit.6). Nifursol je extrahován tetrahydrofuranem v přítomnosti butylhydroxytoluenu jako antioxidantu. Extrakt se po naředění roztokem tetrahydrofuran – voda (1+1) analyzuje na koloně C18 (Zorbax ODS; 4,6x250 mm) za použití mobilní fáze voda-acetonitril (525+475) pH 3,5 upravené kyselinou mravenčí a amoniakem s UV detekcí při 380 nm. Mez stanovitelnosti je 1-2 mg/kg a výtěžnost metody je vyšší než 98 %. Autoři sledovali stabilitu roztoků nifursolu a zjistili, že na stabilitu roztoků má vliv pH roztoku a citlivost na světlo. Při rozpuštění nifursolu v mobilní fázi (pH 3,5) dochází k hydrolýze nifursolu, dokonce i ve tmě a dostáváme nižší výsledky než očekáváme. K rozkladu nedochází ve směsných rozpouštědlech voda – tetrahydrofuran. K zamezení rozkladu nifursolu autoři použili butylhydroxytoluen a při koncentraci 100 mg/ml jsou roztoky nifursolu stabilní nejméně 24 hodin. Byly porovnány rovněž různé způsoby extrakce různými organickými rozpouštědly, jako zcela nevhodné se ukázalo použití způsobu extrakce acetonitrilem v Soxhletově aparatuře popsané v metodě8, kdy dochází k rozkladu při naředění extraktu v mobilní fázi pH 3,5.
K separaci nifursolu se používá reverzní fáze C18 s UV detekcí při 365-380 nm za použití mobilní fáze voda-acetonitril pH 3,5. Validační parametry HPLC metody stanovení nifursolu v krmivech najdete zde.
Porovnání chromatografických kolon k analýze nifursolu a jejich chromatografických parametrů je uvedeno v tabulce:
|
Kolona |
Retenční čas (min) |
Retenční faktor (k´) |
Počet teoretických pater (N) |
Asymetrický faktor (ta) |
|
NovaPak C18 |
5,70 |
1,48 |
4 496 |
1,75 |
|
SymmetryShield RP8 |
6,11 |
3,89 |
7 431 |
1,21 |
|
Agilent Eclipse XDB-C18 |
4,57 |
2,81 |
6 052 |
1,18 |
|
Agilent Zorbax Extend-C18 |
4,29 |
2,58 |
5 470 |
1,26 |
|
Agilent Zorbax SB-C18 |
4,94 |
3,12 |
6 545 |
1,22 |
|
BDS HYPERSIL C18 |
2,06 |
0,71 |
1 843 |
1,39 |
|
SUPELCOSIL ABZ+PLUS |
4,11 |
2,42 |
3 300 |
1,15 |
|
PHENOMONEX Prodigy ODS3 |
6,32 |
4,27 |
8 665 |
1,25 |
|
Symmetry C18 |
4,17 |
2,34 |
4 088 |
1,30 |
Všechny testované kolony se ukazují jako vhodné pro separaci nifursolu, jako nejvýhodnější se ukazuje kolona SUPELCOSIL ABZ+Plus a Agilent Eclipse XDB-C18, jako zcela nevhodná kolona BDS HYPERSIL C18 na které má nifursol nízký retenční faktor k´a účinnost kolony N. Chromatogram separace na koloně NovaPak C18.
Spektrofotometrické stanovení nifursolu je popsáno zde. Nifursol je extrahován dimethylformamidem a extrakt je přečištěn na oxidu hlinitém. Nifursol se detekuje po reakci s fenylhydrazinem za vzniku 5-nitrofurfuralfenylhydrazonu. Reakční produkt se extrahuje do toluenu a stanoví se spektrofotometricky při 515 nm po přídavku hydroxid hyaminu. Do reakce vstupuje pouze část molekuly nifursolu čímž je stanovení méně specifické, ale nedochází k interferencím dalších nitrofuranů.
[1] Zietlow D.C., Morrison J.L.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 53, 1085 (1970).
[2] Koul G.L., Nigam S.S.: Riechstoffe Arom. Körperpflegem 17, 223 (1969).
[3] Wheals B.B., Weston R.E.: Analyst, 96, 78 (1971).
[4] George G.M., Frahm L.J., McDonnell J.P.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 64, 1085 (1981).
[5] Analytical Methods Committee: Analyst 110, 1013 (1985).
[6] De Vries E.J., Bas R.C., Kuil H.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 77, 1347 (1994).
