Dimetridazol je derivátem imidazolu a používá se jako chemoterapeutikum v krmivech pro krůty v dávce 90 mg/kg finálního krmiva k prevenci a terapii histomoniázy.
Metody vysokoúčinné kapalinové chromatografie spojují výhody separace a citlivosti a v současné době jsou používány v této oblasti výhradně. Metoda HPLC[1] pro stanovení dimetridazolu ve finálních krmivech a premixech doplňkových látek používá k extrakci dimetridazolu směsné rozpouštědlo methanol-voda (1+2). Extrakt je přečištěn 3 krát reextrakcí po úpravě pH kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH 1,5 do dichlormethanu a po odpaření dichlormethanu je odparek rozpuštěn v mobilní fázi chloroform-methanol (99,5+0,5) a analyzován na normální fázi silikagelu s UV-detekcí při 308 nm. Mez stanovitelnosti je 7,0 mg/kg. Jones a spolupracovníci[2] vyvinuly jednoduchou HPLC metodu stanovení dimetridazolu v krmivech pro drůbež a prasata. Dimetridazol se extrahuje ze zkušebního vzorku směsným rozpouštědlem acetonitril-voda (2+3) a poté je přímo analyzován na reverzní fázi za použití mobilní fáze acetonitril+voda (3+7) s UV-detekcí při 309 nm. Výtěžnost metody se pohybuje mezi 96 – 109 % pro finální krmiva při obsahu dimetridazolu 45 – 450 mg/kg. V roce 1987 publikoval Roybal a spolupracovníci HPLC metodu stanovení dimetridazolu a ipronidazolu ve finálních krmivech pro prasata pro obsahy od 0,11 do 110 mg/kg[3]. Vzorek smočí fosfátovým pufrem pH 8 a poté se dimetridazol extrahuje methanolem nebo dichlormethanem v závislosti na předpokládaném obsahu dimetridazolu. Methanolový extrakt se po naředění roztokem methanol+acetonitril+voda (5+9,5+85,5) analyzuje přímo. Z dichlormethanového extraktu se dimetridazol reextrahuje 1 mol/l kyselinou chlorovodíkovou a tento extrakt je přímo analyzován. K separaci dimetridazolu a ipronidazolu se používá reverzní fáze C18 s gradientovou elucí z důvodu separace dimetridazolu a ipronidazolu a rovněž i z důvodu eliminace později se eluujících látek při použití isokratické separaci. Výtěžnost dimetridazolu je pro obsah 92,8 mg/kg 108 %, pro obsah 11,2 mg/kg 101% a pro obsah 0,112 mg/kg 100 %. Rychlá metoda stanovení dimetridazolu, ipronidazolu a ronidazolu ve finálních krmivech a premixech byla popsána Tollomellim a spolupracovníky[4]. Všechny analyty jsou extrahovány ze vzorku horkým methanolem, extrakt je přečištěn na krátké chromatografické kolonce s bazickým oxidem hlinitým. K separaci je použita reverzní fáze C18 a mobilní fáze o složení methanol+0,4 % kyselina fosforečná (55+45) s UV detekcí 309 nm. Výtěžnost metody pro obsahy od 10 do 100 mg/kg se pohybuje v rozmezí 97 – 103 %. Jednoduchá a rychlá HPLC metoda stanovení dimetridazolu v premixech a finálních krmivech byla publikována v roce 2000[5]. Dimetridazol se extrahuje vodným methanolem a po přečištění na pevné fázi Alumina B se stanoví na reverzní fázi C18 s UV detekcí při 309 nm za použití mobilní fáze acetonitril-voda (30 + 70). Mez stanovitelnosti byla vypočtena na 2,9 mg/kg a opakovatelnost metody na 4,0 mg/kg pro obsah 20 až 190 mg/kg. Výtěžnost metody pro obsahy 50 až 210 mg/kg je (99,0 ± 1,2) %, pro obsahy 1000 až 31 000 mg/kg (99,2 ± 0,4) %. Byla stanovena hodnota ukazatele opakovatelnosti a reprodukovatelnosti na základě mezilaboratorní porovnávací zkoušky pro premixy doplňkových látek při obsahu 17 000 a 28 000 mg/kg. Ukazatel opakovatelnosti dosahuje hodnoty 5 % relativních a ukazatel reprodukovatelnosti se pohybuje v rozmezí 7-9 % relativních.
Metoda13 byla rovněž zapracována do vyhlášky Ministerstva zemědělství České republiky jako oficiální národní metoda[6].
Stanovení dimetridazolu (RTF formát; 74,8 kB) v krmivech metodou HPLC (PDF formát; 47,7 kB). Dimetridazol se stanoví po extrakci ze vzorku směsným rozpouštědlem methanol-voda a přečištěním extraktu na pevné fázi (SPE v krmných směsích), metodou RP-HPLC s UV detekcí při vlnové délce 309 nm. Chromatogram separace dimetridazolu. Metoda stanovení je validována.
Literatura
[1] Buizer F.G., Severijnen M.: Analyst 96, 854 (1975).
[2] Jones A.D., Burns I.W., Sellings S.G.: Analyst, 104, 265 (1979).
[3] Roybal J.E., Munns R.K., Hurlbut J.A., Shimoda W., Morrison T.R., Vieira C.L.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70, 626 (1987).
[4] Tollomelli E., Laffi R.: J. Assoc. Off. Anal. Chem 75, 663 (1992).
[5] Douša M.: Chem.Listy 94, 326 (2000).
[6] Vyhláška č. 16/2000 Sb. Ministerstva zemědělství, kterou se stanoví metody odběru vzorků, metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů a způsob uchovávání vzorků podléhajících zkáze, ve znění pozdějších předpisů.
