Stanovení avilamycinu metodou HPLC
Validační parametry
Přesnost metody je definována jako těsnost shody získané hodnoty s jeho hodnotou skutečnou přijatou referenční hodnotou. Jedná se tedy o statisticky významnou rozdílnost mezi získanou a skutečnou hodnotou. Nalezené hodnoty modelového vzorku byly s očekávanými hodnotami srovnány pomocí lineární regrese. Očekávané hodnoty byly považovány za nezávisle proměnné, nalezené hodnoty jako závisle proměnné.
Výsledky – krmné směsi
Výsledky měření jsou zahrnuty do tabulky I.
Tabulka I. Výsledky měření – krmné směsi
Statistické parametry |
|
|||
|
Očekávaná hodnota [mg/kg] |
5,0 |
10,0 |
20,0 |
50,0 |
|
Nalezená hodnota [mg/kg] |
4,9 |
9,9 |
21,2 |
51,7 |
|
Výtěžek metody [%] |
97,2 |
99,4 |
105,9 |
103,3 |
|
Interval spolehlivosti |
5,9 |
1,4 |
1,3 |
1,4 |
|
Relativní směrodatná odchylka [%] |
4,73 |
1,15 |
1,02 |
1,10 |
Konstanta a regresního vztahu (konstantní soustavná odchylka) má hodnotu - 0,1979 ± 1,5945 a statisticky se neliší od nuly, konstanta b regresního vztahu (proporcionální soustavná odchylka) má hodnotu 1,040 ± 0,0580 a neliší se statisticky od jedničky.
Shodnost metody je definována jako údaj o míře těsnosti shody mezi vzájemně nezávislými[1] výsledky zkoušek za předem specifikovaných podmínek. Shodnost závisí pouze na rozdělení náhodných chyb a nemá vztah k pravé hodnotě. Míra shodnosti se vyjadřuje (počítá) jako směrodatná odchylka výsledků zkoušek. Shodnost za podmínek opakovatelnosti se vyjadřuje jako opakovatelnost.
Opakovatelnost metody byly vypočtena na základě výsledků měření reálných vzorku krmných směsí a premixů ve dvou paralelních opakování z její směrodatné odchylky.
Po vyloučení odlehlých výsledků (Cochranův test):
Pro obsah od 3 do 35 mg/kg pro krmné směsi je opakovatelnost rmax = 3,6 mg/kg.
Pro obsah od 500 do 5 000 mg/kg pro premixy je opakovatelnost rmax = 278 mg/kg.
Mez detekce a mez stanovitelnosti byla vypočtena z kalibračního modelu, kdy mez detekce odpovídá hodnotě koncentrace, pro kterou je dolní mez (1-a)%ního intervalu spolehlivosti predikce signálu z kalibračního modelu rovna kritické úrovni a mez stanovitelnosti je nejmenší hodnota signálu, pro kterou je relativní směrodatná odchylka predikce z kalibračního modelu dostatečně malá a obyčejně se pokládá hodnotě 0,1.
Meze detekce a stanovitelnosti pro jednotlivé složky avilamycinu jsou sestaveny do tabulky č. 2.
Tabulka č. II Mez detekce a stanovitelnosti avilamycinu
|
Složka avilamycinu |
Mez detekce |
Mez stanovitelnosti |
||
|
|
[mg/l] |
[mg/kg] |
[mg/l] |
[mg/kg] |
|
Avilamycin B |
0,127 |
0,10 |
0,179 |
0,14 |
|
Avilamycin A |
0,570 |
0,46 |
0,644 |
0,52 |
|
Avilamycin |
0,697 |
0,56 |
0,823 |
0,66 |
Při lineární kalibraci je testována volba vhodného kalibračního modelu a výpočet odhadu jeho parametrů a výpočet směrodatné odchylky. Při výpočtu hodnot koeficientů a, b se vycházelo z platnosti modelu regresní závislosti, který předpokládá konstantní rozptyl pro všechny hodnoty závisle proměnné - použití metody nejmenších čtverců.
Vypočtené hodnoty koeficientů a,b a jejich statistické parametry jsou uvedeny v tabulce III.
Tabulka III. Vypočtené hodnoty koeficientů a,b a jejich statistické parametry
|
Parametr |
Odhad |
STDa |
L1,2b |
|
Avilamycin A |
|
|
|
|
a |
372 |
854 |
3676 |
|
b |
20418 |
86 |
371 |
|
Avilamycin B |
|
|
|
|
a |
-630 |
191 |
820 |
|
b |
20445 |
127 |
545 |
a - směrodatná odchylka, b - L1,2 - interval spolehlivosti
Na separaci má vliv pH mobilní fáze, a byl sledován vliv pH na retenci složek avilamycinu, který je uveden v tabulce č. IV.
Tabulka č. 9 Vliv pH mobilní fáze na retenci jednotlivých složek avilamycinu
|
|
pH |
|||
|
Parametr |
6,8 |
7,0 |
7,2 |
7,6 |
|
tR Avilamycin A (min) |
9,01 |
8,92 |
8,69 |
8,06 |
|
tR Avilamycin B (min) |
7,60 |
6,23 |
5,97 |
5,36 |
Reprodukovatelnost retence složek avilamycinu byla vypočtena na základě 14 opakování separace standardu avilamycinu (c = 10 mg/l). Výsledky a vypočtené parametry jsou sestaveny do tabulky č. V.
Tabulka č. V Reprodukovatelnost retence složek avilamycinu při gradientové eluci
|
|
Retence, min |
||||
|
Parametr |
Æ |
minimum |
maximum |
STDa |
% STD |
|
Avilamycin A (min) |
9,52 |
9,44 |
9,60 |
0,05 |
0,54 |
|
Avilamycin B (min) |
7,22 |
7,07 |
7,36 |
0,10 |
1,38 |
a - směrodatná odchylka
[1] Nezávislé výsledky jsou výsledky získané takovým způsobem, že nejsou ovlivněny žádným předchozím výsledkem na tomtéž nebo podobném zkoušeném vzorku