Stanovení monensinu, salinomycinu a narasinu metodou HPLC
Validační parametry
Robustnost metody - derivatizační reakce
Přesnost metody je definována jako těsnost shody získané hodnoty s jeho hodnotou skutečnou přijatou referenční hodnotou. Jedná se tedy o statisticky významnou rozdílnost mezi získanou a skutečnou hodnotou. Nalezené hodnoty modelového vzorku byly s očekávanými hodnotami srovnány pomocí lineární regrese. Očekávané hodnoty byly považovány za nezávisle proměnné, nalezené hodnoty jako závisle proměnné.
Výsledky – krmné směsi
Výsledky měření jsou zahrnuty do tabulky I.
Tabulka I. Výsledky měření - krmné směsi
Statistické parametry |
Očekávaná hodnota [ 10 mg/kg] |
||
|
|
MONENSIN |
Salinomycin |
NARASIN |
|
Nalezená hodnota [mg/kg] |
9.877 |
9.87 |
8.373 |
|
Výtěžek metody [%] |
95.2 |
94 |
97.8 |
|
Směrodatná odchylka [mg/kg] |
0.176 |
0.161 |
0.227 |
Statistické parametry |
Očekávaná hodnota [ 20 mg/kg] |
||
|
|
MONENSIN |
Salinomycin |
NARASIN |
|
Nalezená hodnota [mg/kg] |
20.02 |
19.59 |
20.34 |
|
Výtěžek metody [%] |
100.1 |
98 |
101.7 |
|
Směrodatná odchylka [mg/kg] |
0.576 |
0.433 |
0.625 |
Statistické parametry |
Očekávaná hodnota [ 50 mg/kg] |
||
|
|
MONENSIN |
Salinomycin |
NARASIN |
|
Nalezená hodnota [mg/kg] |
49.35 |
50.78 |
41.26 |
|
Výtěžek metody [%] |
100.4 |
98.8 |
98.3 |
|
Směrodatná odchylka [mg/kg] |
0.24 |
0.791 |
0.249 |
Statistické parametry |
Očekávaná hodnota [ 100 mg/kg] |
||
|
|
MONENSIN |
Salinomycin |
NARASIN |
|
Nalezená hodnota [mg/kg] |
99.67 |
99.83 |
99.51 |
|
Výtěžek metody [%] |
1.731 |
0.335 |
1.83 |
|
Směrodatná odchylka [mg/kg] |
99.7 |
99.8 |
99.5 |
Tabulka II. Výsledky měření - krmné směsi - test regresní rovnicí
|
|
MONENSIN |
Salinomycin |
NARASIN |
|
Konstanta aI) |
-0.1473 |
-0.6106 |
-0.001 |
|
Konstanta bII) |
1.00011 |
1.00348 |
0.99404 |
|
ta |
0.492 |
4.702 |
0.003 |
|
tb |
0.02 |
1.535 |
0.983 |
Vysvětlivky: I - konstantní soustavná odchylka; II - proporcionální soustavná odchylka
Pro všechny analyty platí tb < ttab - rozdíl není statisticky významný a průměry se liší pouze o náhodnou chybu.
Shodnost metody je definována jako údaj o míře těsnosti shody mezi vzájemně nezávislými[1] výsledky zkoušek za předem specifikovaných podmínek. Shodnost závisí pouze na rozdělení náhodných chyb a nemá vztah k pravé hodnotě. Míra shodnosti se vyjadřuje (počítá) jako směrodatná odchylka výsledků zkoušek. Shodnost za podmínek opakovatelnosti se vyjadřuje jako opakovatelnost.
Opakovatelnost metody byly vypočtena na základě výsledků měření reálných vzorku krmných směsí a premixů ve dvou paralelních opakování z její směrodatné odchylky. Výsledky jsou sestaveny do tabulky III.
Tabulka IIIa. Hodnoty opakovatelnosti - premixy doplňkových látek
|
Obsah (mg/kg) |
sx |
rmax/abs/ |
rmax/rel/ |
|
Monensin |
|||
|
od 8 000 do 12 000 |
100,5 |
278 |
2,3 |
|
od 12 001 do 25 000 |
277,5 |
769 |
3,1 |
|
Salinomycin |
|||
|
od 1 000 do 6 000 |
61,2 |
170 |
2,8 |
|
od 6 001 do 15 000 |
295,3 |
818 |
5,5 |
|
Narasin |
|||
|
nedostatečný počet dat ke statistickému vyhodnocení |
|||
Tabulka IIIb. Hodnoty opakovatelnosti - krmné směsi
|
Obsah (mg/kg) |
sx |
rmax/abs/ |
rmax/rel/ |
|
Monensin |
|||
|
od 15 do 80 |
1,4 |
4,0 |
7,2 |
|
od 80 do 120 |
1,8 |
5,0 |
5,1 |
|
Salinomycin |
|||
|
od 10 do 30 |
0,8 |
2,2 |
10,7 |
|
od 30 do 60 |
1,3 |
3,7 |
7,9 |
|
od 60 do 160 |
1,8 |
4,9 |
5,8 |
|
Narasin |
|||
|
od 30 do 75 |
1,4 |
3,8 |
6,6 |
Mez detekce a mez stanovitelnosti byla vypočtena z kalibračního modelu, kdy mez detekce odpovídá hodnotě koncentrace, pro kterou je dolní mez (1-a)%ního intervalu spolehlivosti predikce signálu z kalibračního modelu rovna kritické úrovni a mez stanovitelnosti je nejmenší hodnota signálu, pro kterou je relativní směrodatná odchylka predikce z kalibračního modelu dostatečně malá a obyčejně se pokládá hodnotě 0,1 (tabulka IV).
Tabulka IV. Hodnoty meze detekce a stanovitelnosti
|
IPMA |
Mez detekce [mg/l] |
Mez stanovitelnosti [mg/l] |
Mez stanovitelnosti [mg/kg] |
|
Monensin |
0,022 |
0,044 |
0,18 |
|
Salinomycin |
0,799 |
0,960 |
1,28 |
|
Narasin |
1,510 |
1,626 |
2,6 |
Při lineární kalibraci je testována volba vhodného kalibračního modelu a výpočet odhadu jeho parametrů a výpočet směrodatné odchylky. Při výpočtu hodnot koeficientů a, b se vycházelo z platnosti modelu regresní závislosti, který předpokládá konstantní rozptyl pro všechny hodnoty závisle proměnné - použití metody nejmenších čtverců.
Vypočtené hodnoty koeficientů a,b a jejich statistické parametry jsou uvedeny v tabulce V.
Tabulka V. Vypočtené hodnoty koeficientů a,b a jejich statistické parametry
|
Parametr |
Odhad |
STDa |
L1,2b |
|
|
Monensin |
||
|
a |
32 034 |
481 |
2 068 |
|
b |
152 190 |
22 |
94 |
|
|
Salinomycin |
||
|
a |
-1 711 |
3 139 |
13 507 |
|
b |
54 649 |
143 |
614 |
|
|
Narasin |
||
|
a |
6 559 |
5 509 |
23 704 |
|
b |
50 723 |
250 |
1 077 |
a - směrodatná odchylka, b - L1,2 - interval spolehlivosti
Kalibrační přímka je lineární v rozsahu 4 - 40 mg/l při nástřiku 50 ml (tj. v rozsahu od 0,2 do 2 mg).
Na odezvu detektoru při stanovení IPMA mají vliv následujíc faktory:
a) teplota derivatizační reakce
b) průtok mobilní fáze a derivatizačního činidla
c) koncentrace kyseliny sírové a derivatizačního činidla
Reakce probíhá v prostředí kyseliny sírové při teplotě 95 oC. Vliv teploty postkolonového systému na velikost odezvy detektoru postkolonové reakce ionophorů s derivatizačním činidlem byla sledována řadou autorů[1],[2],[3] a je všeobecně známa. Absorbance každé ze sledovaných látek vzrůstá s teplotou v reakčním prostředí. Odezva jednotlivých ionophorů roste lineárně až do 90 oC, u salinomycinu je nárůst odezvy až do 95 oC, aby poté opět došlo ke snížení odezvy detektoru.1
Chromatografický proces byl optimalizován na základě optimalizace průtoku derivatizačního činidla (FDR), průtoku (FMP) a plochy píku příslušného ionophoru. Největší citlivosti se dosahuje při průtoku mobilní fáze 0,6 ml/min a průtoku derivatizačního činidla 0,8 ml/min při složení mobilní fáze methanol-5 % kyselina octová (925+75).
Velikost odezvy ale ovlivňuje zejména koncentrace kyseliny sírové a použitého derivatizačního činidla, s rostoucí koncentrací kyseliny i činidla stoupá odezva detektoru, toto je však omezeno určitou koncentrací použitého činidla (při vysoké koncentraci činidla dochází ke krystalizaci derivatizačního činidla v systému. Byl studován vliv koncentrace kyseliny sírové a derivatizačního činidla (p-DMBA) na směrnici kalibračních křivek monensinu pro koncentraci kyseliny sírové 19,3 - 38,6 - 58,0 - 77,3 a 96,6 g/l při koncentraci p-DMBA 31,5 g/l a koncentraci derivatizačního činidla 10,5 - 21,0 - 31,5 - 42,0 a 63,0 g/l při koncentraci kyseliny sírové 77,3 g/l.
[1] Nezávislé výsledky jsou výsledky získané takovým způsobem, že nejsou ovlivněny žádným předchozím výsledkem na tomtéž nebo podobném zkoušeném vzorku
