THEOBROMIN
Theobromin patří mezi purinové alkaloidy kávy, kakaa a čaje společně s kofeinem a theofylinem.
Purinové alkaloidy se izolují do zředěných vodných roztoků kyselin a reextrakcí do chloroformu nebo přímo extrakcí do chloroformu a následném přečištění. K dělení se dříve používala především TLC (silikagel) nebo GC, dnes především HPLC. Zajímavá je gravimetrická metoda stanovení kofeinu a theobrominu. Po extrakci zředěnou kyselinou sírovou následně chloroformem na Soxhletově extraktoru se odpaří chloroform do sucha a směs kofeinu a theobrominu se stanoví vážkově. Kofein se oddělí rozpuštěním v tetrachlomethanu a po odpaření rozpouštědla se theobromin stanoví vážkově.
Stanovení theobrominu v krmivech se uskutečňuje především metodami HPLC. Theobromin je extrahován z navážky krmiva 5 – 10 g horkou vodou. Extrakt se vyčeří Carrezovými činidly a takto vyčeřený extrakt se analyzuje na chromatografické koloně (Partisil P x S 10-25 ODS) při průtoku mobilní fáze 0,8-1,0 ml/min s UV detekcí při 272 nm. Mez stanovitelnosti se pohybuje okolo 20 mg/kg a výtěžnost metody 90 %.[1] Metoda ke stanovení obsahu theobrominu ve finálním krmivu a v surovinách je popsána i v metodikách VD LUFA.[2] Zkušební vzorek se extrahuje amoniakálním roztokem chloroformu, alikvotní podíl extraktu se odpaří k suchu a odparek se rozpustí ve vodě. Extrakt se odtuční protřepáním s hexanem, alikvotní část vodné fáze se naředí roztokem acetonitril + voda. Theobromin se stanoví metodou HPLC na reverzní fázi C18 za použití mobilní fáze acetonitril+voda+kyselina fosforečná (90+920+1) s detekcí UV při vlnové délce 272 nm. Chromatogram separace theobrominu v reálném vzorku-kakaové slupky.
Separace kofeinu, theobrominu a theofylinu se uskutečňuje nejlépe isokratickou nebo gradientovou elucí na reverzní fázi C18 (ukázka separace). Jako příklady je možné uvést separaci a stanovení těchto methylxantinů v nápojích a moči[3] nebo v čokoládových výrobcích.[4] V prvém případě jako mobilní fáze byla použita: methanol–voda–kyselina octová nebo ethanol–voda– kyselina octová (20:75:5, v/v/v) při průtoku 0,7 ml/min a UV detekci 273 nm. Detekční limit je 0,1 pg/l. Ve druhém případě separace probíhala na koloně Prodigy 5[mm] ODS3 100 150 X 4.60 mm s mobilní fází acetonitril-voda (10:90) pH 3 (kyselina fosforečná) při průtoku 1,0 ml/min a UV detekci 280 nm. K separaci všech tří purinových alkaloidů se osvědčila nejvíce separace na chromatografické koloně RPAmide C16, 3,0x150 mm za použití mobilní fáze methanol - 2 % kyselina octová (88+12) při průtoku 0,5 ml/min s UV detekcí 272 nm.
Další odkazy:
Separation of the xanthine stimulants caffeine, theophylline and theobromine
