Stanovení mykotoxinů
Stanovení aflatoxinů
Extrakce a přečištění extraktu
Způsob extrakce závisí především na fyzikálně-chemických vlastnostech komodit kontaminovaných aflatoxiny a na zvoleném způsobu přečištění extraktů. Způsob extrakce závisí na obsahu tuku, vlhkosti a obsahu aflatoxinů. Proto se jako rozpouštědla používají polární rozpouštědla typu methanolu nebo středně polární rozpouštědla jako je aceton a chloroform nebo jejich směsi.[1] Ke zvýšení rozpustnosti tuků byly popsány směsná rozpouštědla s přídavkem hexanu.
K přečištění a zakoncentrování extraktu se používají jednak historické metody extrakce z kapalina do kapaliny, moderní technika extrakce na tuhou fázi silikagelu,[2] oktadecylu[3] nebo fenylu[4] a v neposlední řadě imunoafinitní kolonky.[5][6][7][8] Přečištění na imunoafinitních kolonkách bylo také převzato do norem České republiky a Evropské unie.[9][10]
Metody stanovení
V běžném screeningu se většinou využívá imunoenzymatických analýz (ELISA) nebo chromatografie na tenké vrstvě. Nejpřesnější metodou, která je v současné době považována za standardní, je vysokoúčinná kapalinová chromatografie, na kterou bude dále zaměřena hlavní pozornost.
V počátcích se k analýzám aflatoxinů používala nejčastěji normální silikagelová fáze s UV detekcí, což nevyhovovalo ke stanovení velmi nízkých obsahu těchto toxinů ve sledovaných komoditách.[11] Použití citlivější, fluorescenční detekce, bylo omezeno použitím nepolárních mobilní fází (chloroform, dichlormethan) v nichž jsou fluorescenční výtěžky velmi nízké a bylo omezeno pouze na aflatoxiny G1 a G2. K detekci všech čtyř aflatoxinů pak bylo nutné použít simultánní UV a fluorescenční detekci.[12] Manabe a spol. zjistil,[13] že přídavek kyselin do mobilní fáze zvyšuje fluorescenční výtěžek aflatoxinů B1 i B2 a tento způsob se často používal.[14][15][16]
K separaci aflatoxinů se v současné době používá s výhodou reverzní fáze (C18) za použití mobilní fáze acetonitril - voda nebo methanol - voda, ale v těchto vodných fázích jsou velmi nízké flourescenční výtěžky aflatoxinu B1 a G1 (cit.[17][18]). Z tohoto důvodu se ke snížení meze detekce používají různé způsoby derivatizace před nebo za chromatografickou kolonou.
Předkolonová derivatizace se provádí kyselinou trifluoroctovou převedením aflatoxinu B1 a G1 na hemiacetaly B2a a G2a, které mají asi 10krát vyšší odezvu při fluorescenční detekci.[19] Konverze na hemiacetaly (I) se provádí v aprotních rozpouštědlech (nejčastěji hexanu), protože v prostředí methanolu vznikají methylacetaly, které jsou málo stabilní. Derivát se pak odpaří k suchu, odparek se rozpustí v acetonitrilu nebo směsi acetonitril - voda. Derivatizace kyselinou trifluoroctovou byla aplikována v celé řadě stanovení aflatoxinů v různých potravinách.[21][22][23][24][25]
I. Hydratační produkty konverze aflatoxinů
Postkolonová derivatizace aflatoxinů se provádí několika způsoby za použití rozdílných derivatizačních činidel. Davis a Diener první popsali, že aflatoxiny B1 a G1 poskytují obdobné fluorescenční deriváty oxidací jódem[26] a vlastní HPLC metoda byla popsána později.[27] Vlastní reakce je velmi rychlá a proběhne mezi 3 - 5 s při teplotě nejméně 60 °C. Optimální teplota je pak 75 °C s nasyceným roztokem jódu,[28] který se připraví rozpuštěním 100 mg jódu ve 2 ml methanolu a naředí se na konečný objem 200 ml vodou. Tato metoda byla aplikována ke stanovení aflatoxinů v krmivech,[29] byla také převzata jako oficiální metoda sdružení AOAC-IUPAC[30] a používá se ke stanovení aflatoxinů v cereáliích.10 Nevýhodou použití jódu je nízká stabilita derivatizačního činidla (maximálně týden při skladování ve tmě a chladu), vysoká koncentrace jódu v činidle, vysoká teplota a v neposlední řadě dochází ke zředění analytu derivatizačním činidlem. Proto se často používá derivatizace brómem. Prozatím byly popsány dva způsoby postkolonové derivatizace bromem. Protože je brom ještě méně stabilním činidlem než jód, používá se jako derivatizační roztok bromid draselný (přibližné koncentrace 0,1 mol/l) v prostředí 0,1 mol/l kyseliny dusičné.11 Volný brom se pak generuje "in-situ" pomocí elektrochemických generátorů proudem řádově 20 - 100 µA.[31],[32],[33],[34] Při tomto způsobu je nutné použití elektrochemickém generátoru (KOBRA cellÒ) a současně dochází ke snížení účinnosti systému vlivem zvýšení mrtvého objemu za chromatografickou kolonu. Nevýhodou této metody je také nižší životnost kolony z důvodu použití kyseliny dusičné do mobilní fáze. Výhodou této metody je, že odpadá nutnost použití postkolonového derivatizačního systému, nedochází ke zředění analytu činidlem, čímž dochází současně ke snížení meze stanovitelnosti. Většinu výše popsaných nevýhod odstraní použití pyridinbromidu perbromidu (C5H5N.HBr.Br2; Mr=319,82 g/mol), který se používá jako zdroj volného bromu při derivatizaci za kolonou.[35] Koncentrace pyridinbromidu perbromidu v derivatizačním činidle se pohybuje okolo 0,15 mol/l ve vodě. Stabilita roztoku je asi 4 dny při laboratorní teplotě Derivatizace probíhá za laboratorní teploty při poměru toku mobilní fáze a derivatizačního činidla 3:1.
V roce 1988 studoval Francis a spol.[36] interakci aflatoxinů s ß-cyklodextriny a zjistil, že vznikající komplexy cyklodextrinu (CD) s aflatoxiny B1 a G1 vykazují zvýšení intensity fluorescence. Tohoto poznatku bylo později využito k postkolonové derivatizaci,[37] byly publikovány termodynamické studie komplexů heptakis-2,6-ortho-dimethyl-ß-CD, ß-CD, a-CD a g-CD, jejich fluorescenční výtěžky a vhodnost k postkolonové derivatizaci.[38],[39] Mechanismus, který umožňuje zvýšení fluorescenčních výtěžků není dosud dobře prostudován. S největší pravděpodobností dochází k uzavření molekuly aflatoxinu do dutiny, které tvoří molekuly cyklodextrinu, za vzniku inkluzního komplexu. U takto fixované molekuly dojde ke změně jejího vibračního stavu, což umožňuje excitaci této molekuly.38 Koncentrace cyklodextrinu ve vodě jako derivatizačního činidla je omezena rozpustností cyklodextrinů a pohybuje se okolo 0,01 mol/l. Reakce probíhá za laboratorní teploty v reakční smyčce o vnitřním průměru 0,016 mm a délce 30 cm při průtoku 1 ml/min. Mez detekce aflatoxinů byla vypočtena na 4 µg/l.
Ke konverzi na hemiacetaly (I) bylo využito i in-line spojení chromatografické kolony s fotochemickým reaktorem. Ve fotochemickém reaktoru probíhá fotolytická reakce (ozářením ultrafialovým světlem) a dochází k již popsané konverzi aflatoxinu B1 a G1 na hemiacetaly B2a a G2a. Fotolytická reakce je reprodukovatelná a nejvěších fluorescenčních výtěžků se dosahuje při reakční době 90 s a vyšší (pro vnitřní objem reakční kapiláry 1 ml). Tento způsob derivatizace byl použit při stanovení aflatoxinů v kukuřici a mez stanovitelnosti je 0, 25 ppb pro aflatoxin B2 a 1 ppb pro B1.[40]
Přehled metod stanovení mykotoxinů
Literatura
[1] Bullerman L.B., v knize Food and Beverage Mycology, editor Beuchat L.R., 2 vydání, AVI, New York 1987.
[2] Trucksess M.W., Stoloff L.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 67, 317 (1984).
[3] Tomlins K.I., Jerwers K., Coker R.D., Nagler M.J.: Chromatografia 27, 67 (1989).
[4] El-Nezami H.S., Nicoletti G., Neals G.E., Donohue D.C., Ahokas J.T.: Food Chem. Toxicol. 33, 173 (1995).
[5] Sharma M., Márquez C.: Animal Feed Sci. Tech. 93, 109 (2001).
[6] Stroka J., van Otterdijk R., Anklam E.: J. Chromatogr. A 904, 251 (2000).
[7] Kaniou-Grigoriadou I., Eleftheriadou A, Mouratidou T., Katikou P.: Food Control 16, 257 (2005).
[8] Aycicek H., Aksoy A. Saygi S.: Food Control 16, 263 (2005).
[9] ČSN EN 12955 - Potraviny - Stanovení aflatoxinu B1 a sumy aflatoxinů B1, B2, G1 a G2 v cereáliích, skořápkových plodech a podobných výrobcích - Metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie s postkolonovou derivatizací a přečištěním na imunoafinitní koloně, ČNI Praha 2000.
[10] ČSN EN 14123 - Potraviny - Stanovení aflatoxinu B1 a sumy aflatoxinů B1, B2, G1 a G2 v burských oříšcích, pistáciích, fících a práškové paprice - Metoda HPLC s postkolonovou derivatizací a s předčištěním na imunoafinitivní kolonce, ČNI Praha 2004.
[11] Wei R.D., Chang S.Ch., Lee S.S.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 63, 1269 (1980).
[12] Pons W.A., Franz A.O.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 61, 793 (1978).
[13] Manabe M., Goto T., Matsuura S.: Agric. Biol. Chem. 42, 2003 (1978).
[14] Howell M.V., Taylor P.W.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 64, 1356 (1981).
[15] Goto T., Manabe M., Matsuura S.: Agric. Biol. Chem. 43, 2591 (1979).
[16] Goto T., Manabe M., Matsuura S.: Agric. Biol. Chem. 46, 801 (1981).
[17] Holcomb M., Wilson D.M., Trucksess M.W., Thompson H.C. Jr.: J. Chromatogr. 624, 341 (1992).
[18] Kok W.T.: J. Chromatogr. B 659, 127 (1994).
[19] Takahashi D.M.: J. Chromatogr. 131, 147 (1977).
[20] Beebe R.M.: J. Assco. Off. Anal. Chem. 61, 1347 (1978).
[21] Cohen H., Lapointe M.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 64, 1372 (1981).
[22] Hutchins J.E., Hagler W.M. Jr.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 66, 1458 (1983).
[23] Saad A.M., Abdelgadir M., Moss M.O.: Food. Addit. Contam. 12, 225 (1995).
[24] Roch O.G., Blunden G., Coker R.D., Nawaz S.: Chromatografia 33, 208 (1992).
[25] Akiyama H., Goda Y., Tanaka T., Toyoda M.: J. Chromatogr. A 932, 153 (2001).
[26] Davis N.D., Diener U.L.: J. Appl. Biochem. 1, 115 (1979).
[27] Davis N.D., Diener U.L.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 63, 107(1980).
[28] Sheperd M.J., Gilbert J.: Food. Addit. Contam. 1, 325 (1984).
[29] Van Egmond H.P., Paulsch W.E., Sizoo E.A.: Food. Addit. Contam. 5, 321 (1988).
[30] Association of Official Analytical Chemists, v Official Methods of Analysis, Method 991.31., 15. vydání, AOAC, Arlington, VA USA 1991.
[31] Kok W.T., Brinkman A.T., Frei R.W.: Anal. Chim. Acta 162, 19 (1984).
[32] Dorner J.W., Cole R.J.: J. AOAC Int. 79, 983 (1993).
[33] Scholten J.M., Spanjer M.C.: J. AOAC Int. 79, 1360 (1996).
[34] Reif K., Metzger W.: J. Chromatogr. A 692, 131 (1995).
[35] Garner R.C., Whattam M.W., Taylor P.J.L., Stow M.W.: J. Chromatogr. 648, 485 (1993).
[36] Francis O.J., Kirschenhenter J.G.P., Ware G.M., Carman A.S., Kuan S.S.: J. Assoc. off. Anal. Chem. 71, 725 (1988).
[37] Cepeda A., Prognon P., Mahuzier G., Blais J.: Anal. Chim. Acta 211, 331 (1988).
[38] Vázquez B.I., Cepeda A., Prognon P., Mahuzier G., Blais J.: Anal. Chim. Acta 269, 239 (1992).
[39] Cepeda A., Franco C.M., Fente C.A., Vázquez B.I., Rodriguez J.L., Prognon P.: J. Chromatogr. A 721, 69 (1998).
[40] Joshua H.: J. Chromatogr. A 654, 247 (1993).