Karotenoidy
HPLC metody stanovení karotenoidů
Stanovení ß-karotenu v krmivech spektrofotometrickou metodou
Způsob extrakce karotenoidů závisí na tom, zda vlastní extrakci předchází saponifikační krok či nikoli. Při přímé extrakci je použité extrakční činidlo důležité vzhledem ke stabilitě karotenoidů ve smyslu jejich možné isomerace a oxidace. Jako nejvýhodnější se jeví THF, methanol a acetonitril, ale zde je omezena rozpustnost karotenů. THF musí být stabilizován antioxidanty (BHT) vzhledem k jeho náchylnosti k oxidaci. Přídavek uhličitanu vápenatého, uhličitanu hořečnatého nebo sodného, triethylaminu a oxidu hořečnatého do extrakčního systému slouží k neutralizaci organických kyselin a udržení neutrálního nebo alkalického extrakčního prostředí. Vzhledem k lepší rozpustnosti karotenoidů v chlorovaných rozpouštědlech se používají také jako extrakční systémy, ale v těchto rozpouštědlech (chloroform, dichlormethan) dochází bohužel k významné rovnováze mezi 9-cis a 13-cis isomery karotenů. Proto se používají nechlorovaná, méně polární organická rozpouštědla a jejich směsi: aceton – hexan, ethanol – hexan, ethylacetát – hexan, ethylacetát - petrolether nebo methanol – tetrahydrofuran.
K zamezením ztrát karotenoidů na minimum během analýzy je nutné dodržovat následující doporučení:
a) zamezení přístupu vzdušného kyslíku probubláváním reakčního prostředí dusíkem
b) přídavek antioxidantů (BHT, pyrogallol, kyselin askorbová)
c) k zamezení isomerace je vhodné udržovat teplotu co nejnižší. Při zakoncentrování roztoků by teplota neměla překročit 40°C, roztoky by měly být skladovány při teplotě – 20°C
d) měl by být zamezen přístup přímého slunečního světla a pracovat v umělém osvětlení; roztoky by měly být skladovány v tmavém skle (amber).
e) všechny roztoky musí být prosté kyselin, je vhodný přídavek triethylaminu o koncentraci 0,001 % k neutralizaci volných kyselin
V případě použití alkalické hydrolýzy se používá hydrolýza 10 % methanolickým roztokem KOH za studena po dobu 16 hodin. Alkalická saponifikace je vhodná pro zelené rostliny, kdy alkalická hydrolýza rozkládá chlorofyly, které by mohly být jinak příčinou fotoisomerace karotenoidů.
Sloupcová chromatografie a TLC byly použity ke stanovení karotenoidů s mnoha druhy adsorbentů jako je směs hydroxidu hořečnatého a vápenatého[1] a oxidu hořečnatého[2] nebo oxidu hlinitého (dále jen alumina) se spektrofotometrickou koncovkou[3],[4],[5],[6]. Pořadí separace karotenoidů na alumině je pak chlorofyl, xanthofyl, kryptoxanthin, karoteny.
Metody stanovení založené na vysokotlaké kapalinové chromatografii používají k separaci normální i reverzní fázi. Jako sorbenty na normální fázi se používá alumina k separaci all-trans-b-karotenů a jejich cis-isomerů za použití mobilní fáze isooctan s přídavkem 0,5 % tetrahydrofuranu (THF). Cis-isomery jsou eluovány před all-trans-isomery[7] a za těchto podmínek jsou g-karoteny, canthaxantin a b-cryptoxanthin zadržovány na koloně.
Hydroxid vápenatý je ideálním sorbentem pro separaci isomerů karotenoidů. Ve srovnání s aluminou je méně citlivý k teplotě a obsahu vody v mobilní fázi[8]. Hydroxid hořečnatý usnadňuje separaci všech all-trans-b-karotenů a jejich 9-, 13- a 15-cis isomerů[9]. Sorbent silikagel (silica) je pro separaci karotenoidů nevhodný, protože karotenoidy jsou velmi slabě adsorbovány a jsou eluovány jako skupina karotenoidů, zatímco polární xanthophyly jsou zadržovány velmi silně. Další nevýhodou sorbentu silica je jeho neschopnost separovat a,b-karoteny i za použití gradientové eluce[10]. Separace a,b, g-karotenů probíhá na NH2-fázi za použití mobilní fáze isooctan s přídavkem 0,5 % THF, zatímco kanthaxantin a b-cryptoxanthin jsou silně zadržovány7. Cis-isomery b-karotenu jsou separovány od all-trans-isomerů a tímto NH2-fáze dává alternativní výběr ke koloně alumina bez interferencí jejich stereoisomerů.
Reverzní fáze je častěji používána k separaci karotenoidů, protože jejich retence na reverzní fázi je větší než na normální fázi a současně je dosažena separace a a b-karotenů a xanthophyly jsou eluovány před karotenoidy. Nevýhodou reverzní fáze je, že karotenoidy jsou pouze méně rozpustné v typických rozpouštědlech pro reverzní fázi (methanol, acetonitril) a se zvyšujícím se obsahem vody jejich rozpustnost klesá. Nelis a de Leenher dosáhli při isokratické eluci separaci 9 karotenoidů v mobilní fázi acetonitril/dichlormethan/methanol (70+20+10) na koloně Zorbax ODS[11]. Nepolární karotenoidy jsou zadržovány na reverzní fázi vlivem hydrofobních interakcí s ligandy C8, C18, zatímco retence polárních xanthophylů je řízena volnými stéricky dostupnými silanolovými skupinami. Zvýšení eluční síly mobilní fáze může být dosaženo použitím alternativní mobilní fáze acetonitril/dichlormethan/methanol (65+25+10), čímž dochází k separaci b-cryptoxanthinu, a- a b-karotenu od ostatních komponent v relativně krátkém čase[12].
K detekci karotenoidů se používá UV detekci v oblasti 400 – 500 nm v závislosti na stanovovaných karotenoidech. Proto se s výhodou používá UV detektor s programovatelnou vlnovou délkou nebo detektor diodového pole. Ke kvantifikaci se využívá nejčastěji externí kalibrace ale s úspěchem byly použity i vnitřní standardy: ß-apo-8´-karotenal, retinol palmitát, isozeaxanthin nebo decapreno-ß-karoten. Při použití externí kalibrace se používají komerčně dodávané standardy karotenoidů (CaroteNatur, Lupsingen, Švýcarsko, www.carotenature.com) nebo se mohou laboratorně připravovat např. extrakcí z kukuřice a přečištění sloupcovou chromatografií. Ke kvantifikaci cis-isomerů karotenoidů se používá externí kalibrace cis-isomerů nebo se využívá jejich podobných spektrálních vlastností s trans-isomery a kvantifikují se na externí kalibraci trans-isomerů.
|
Matrice |
Extrakce |
HPLC podmínky |
Citace |
|
|
a- a b-karoteny, b- kryptoxanthin |
zelenina, ovoce |
extrakce THF+Na2SO4+MgCO3 |
Partisil ODS 5 mm; ACN+THF+H2O (85+12,5+2,5); UV 470 nm |
|
|
a- karoten, all-trans-b-karoteny |
zelenina, ovoce |
extrakce THF |
Vydac 218 TP54 C18 5 mm; MeOH+ACN+THF (56+40+4); UV 470 nm |
|
|
a- karoten, all-trans-b-karoteny |
zelenina |
extrakce THF+Na2SO4+MgCO3 |
Spheri-5 ODS 5 mm; ACN+CH2Cl2+MeOH (70+20+10); UV 450nm |
b-karoten se stanoví po enzymatické hydrolýze směsí enzymů pepsin - trypsin (1:1) v alkalickém prostředí, rozpuštěním v acetonu a následnou extrakcí do hexanu, spektrofotometricky při vlnové délce 451 nm.
[1] Sweenz J.P., Marsh A.C.: J.Assoc.Off.Anal.Chem. 53, 937 (1970)
[2] Stewart I., Wheaton T.A.: J. Chromatogr. 55, 325 (1971)
[3] Swarzmüller J.: Handbuch der Lebensmittelchemie; Die Bestnadteile der Lebensmittel, Springer, Berlin (1965)
[4] AOAC, 15th, Inc. Arlington, VA, Section 941.15 (1990)
[5] ČSN 56 0053 Stanovení b-karotenů a retinolu, ÚNM, Praha 1971
[6] Weerdhof Van der T., Wiersum M.L., Reissenweber H.: J. Chromatogr. 83, 455 (1973)
[7] Bushway R.J.: J. Liquid Chromatogr. 8, 1527 (1985)
[8] Tsukida K., Saiki K., Takii T., Koyama Y.: J. Chromatogr. 245, 359 (1982)
[9] O´Neil C.A., Schwartz S.J., Catignani G.L.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 74, 36 (1991)
[10] Fiskdahl A., Mortensen J.T., Liaaen-Jensen S.: J. Chromatogr. 157, 111 (1978)
[11] Nelis N.J.C.F., de Leenher A.P.: Anal. Chem. 55, 270 (1983)
[12] Lauren D.R., Mc Naughton D.E.: J. Liquid Chromatogr., 9, 2013 (1986)
[13] Bureau J.L., Bushway R.J.: J. Food. Sci. 51, 128 (1986)
[14] Bushway R.J.: J. Agric. Food Chem. 34, 409 (1986)
[15] Granado F., Olmedilla B., Blanco I., Rojas-Hidalgo E.: J. Agric. Food Chem. 40, 2135 (1992)
