Stanovení tryptofanu

Při kyselé hydrolýze vzorku, která se obvykle k hydrolýze používá, dochází k rozkladu tryptofanu a proto se většinou používá alkalická hydrolýza. Matsubara a Sasaki objevili, že za přítomnosti thioglykolové kyseliny dochází k poklesu destrukce tryptofanu a výtěžek se pohybuje kolem 80-90 %. Tento způsob hydrolýzy se však neujal z důvodu nízké výtěžnosti a eliminaci ochranného účinku thioglykolové kyseliny v přítomnosti cukrů. Přesto byl stanoven obsah tryptofanu kolorimetricky ve vlně po předchozí kyselé hydrolýze 18 N H₂SO₄ při teplotě 70 ° C po dobu 2 hodin.[1] Další podrobnosti naleznete zde. 

Při spektrofotometrickém stanovení se využívá různých specifických kondenzačních reakcí. Jednou z prvních metod stanovení tryptofanu byla metoda Hopkinse a Colea,[2] která byla založena na kondenzační reakci tryptofanu s kyselinou glyoxalovou a následnou oxidací (dusitan sodný) vzniklého produktu, přičemž výsledný produkt je nápadně podobný struktuře ninhydrin-chromoforu (Ruhemanův purpur). Tryptofan se z reakčního prostředí vysráží rtuťnatou solí, která se rozpustí následně reakčním prostředí. Tato reakce byla často modifikována.[3],[4],[5],[6] Pravděpodobný chemismus reakce je znázorněn na obrázku.

Obdobně se využívá reakce s p-dimethylaminobenzaldehydem v prostředí kyseliny sírové a následnou oxidací vzniklého produktu perocidem vodíku nebo dusitanem sodným.[7],[8] Způsob oxidace produktu byl srovnán v roce 1940.[9] Na obrázku je znázorněn pravděpodobný chemismus reakce. Pouhou úvahou je možné dospět k závěru, že reakce je chemismus reakce je obdobný reakci pyrrolů s aldehydy, která vede k porfirinovým pigmentům (A).[10] Oxidací pak dostáváme strukturu s chromoforem okolo 600 nm (B). Struktura (A) je více pravděpodobná.[11] Bylo zjištěno, že při této metodě dochází k interferencím zejména za přítomnosti oxidačních a redukčních činidel zahrnující H₂S, siřičitany, peroxid vodíku a chloridové ionty[12],[13] a tyto interference se eliminují přídavkem síranu stříbrného.[14]

Další specifické stanovení je využití reakce s xanthydrolem,[15] této reakce se využívá i po dělení tryptofanu na TLC.

Při stanovení tryptofanu se nejčastěji používá metoda HPLC s fluorescenční detekcí při vlnové délce 355 nm s excitační vlnovou délkou 283 nm.[16],[17] Metoda HPLC s fluorescenční detekcí[18] poskytuje proti střednětlaké ionexové chromatografii s postkolonovou derivatizací[19] ninhydrinem srovnatelné výsledky, výhodou je nižší mez stanovitelnosti HPLC metody, která dosahuje 25 mg/kg.

Porovnání metody stanovení tryptofanu metodou HPLC s fluorescenční detekcí a střednětlaké ionexové chromatografie.

Pokud máte zájem o HPLC metodu stanovení tryptofanu pak můžete napsat E-mail.

Literatura