Home
Stanovení aminokyselin v krmivech
Příprava hydrolyzátu pro stanovení aminokyselin
Úvod
Stanovení aminokyselin v krmivech a potravinách je jedna z nejpracnějších a nedražších analytických operací v oblasti analýz krmiv a potravin vůbec. Stanovení aminokyselin je spojeno se dvěma okruhy problémů, jejichž optimální řešení dosud nebylo zcela nalezeno. V prvé řadě je nutné zajistit převedení aminokyselin, které jsou převážně vázané v bílkovinách, do formy volných aminokyselin a to beze ztrát těchto aminokyselin. V druhé řadě se musí zvolit taková metoda dělení a stanovení aminokyselin, která zaručuje dostatečnou přesnost a správnost, musí být dostatečně rychlá a experimentálně nenáročná. Analytika aminokyselin je navíc komplikována přítomností dalších složek v krmivu, které dané stanovení mohou rušit nebo mohou dávat pozitivní chyby. Kromě bílkovinných aminokyselin jsou typickými složkami také aminokyseliny, které bývají přítomny volné nebo v peptidech, nikoli vázané v bílkovinách. Je to např. b-alanin a g-aminomáselná kyselina, které vznikají enzymovou dekarboxylací asparagové a glutamové kyseliny, a ornitin. Ve vzorcích živočišného i rostlinného původu obsahujících glykoproteiny se vyskytují aminocukry jejichž rozkladem mohou vznikat aminy, které vznikají také termickou degradací aminokyselin i při relativně nízkých teplotách nebo bakteriálním rozkladem. Bakteriální dekarboxylací histidinu vzniká histamin, termickou degradací z methioninu vzniká krotylamin[1], z tryptofanu tryptamin, z tyrosinu tyramin[2]. Některé bílkoviny obsahují méně běžné hydroxylované aminokyseliny (hydroxyprolin, hydroxylysin).
Příprava hydrolyzátu pro stanovení aminokyselin
V peptidech a bílkovinách jsou aminokyseliny vzájemně vázány peptidovými vazbami, takže se z těchto vazeb musí uvolnit hydrolýzou. Hydrolýza může probíhat v kyselém nebo alkalickém prostředí. Při kyselé hydrolýze se materiál hydrolyzuje za varu přebytkem konstantně vroucí kyselinou chlorovodíkovou c(HCl) = 6 mol/l. Výhodou kyselé hydrolýzy je, že nedochází k racemizaci, a L-konfigurace aminokyselin zůstává zachována. V literatuře byl diskutován vliv koncentrace a čistoty použité kyseliny chlorovodíkové, doba a čas analýzy, přítomnost cukrů, aldehydů a kovů v matrici a kinetika hydrolýzy.[3],[4],[5]. Během hydrolýzy, která trvá 12 až 70 hodin při teplotě 100 až 110 °C, dochází k rozkladu tryptofanu a sirných aminokyselin, asparagin se hydrolyzuje na asparagovou kyselinu a glutamin na glutamovou kyselinu za uvolnění amoniaku ve formě amonné soli. Rychlost rozkladu peptidických vazeb se liší podle struktury a druhu jednotlivých aminokyselin. Aminokyseliny uvolněné z peptidických vazeb mohou dále podléhat různým rozkladným reakcím. Pro stanovení přesných obsahů isoleucinu a valinu, které jsou obtížně uvolňovány ze svých peptidických vazeb, se musí použít hydrolýza pod dobu 70 hodin, u threoninu a serinu podle různých autorů dochází ke ztrátám ve výši 3-16 %, u tyrosinu jsou uváděny ztráty kolem 1-14 %. Tyrosin může ještě být v přítomnosti oxidačních činidel oxidován nebo může přecházet na chloroderiváty. Pro získání údajů o skutečném obsahu labilních aminokyselin byla navržena řada metod. Ke korekci na nulový čas hydrolýzy se používá jednak grafická interpolace[6] nebo řešení metodou lineárních nejmenších čtverců[7] - ty však vyžadují 4-5 dob hydrolýzy. Jednoduchý způsob7 je předpoklad reakční kinetiky I. řádu - to vyžaduje provedení dvou časů hydrolýz - při t1 = 20 hodin a t2 = 70 hodin a výpočet původního obsahu Ao podle vzorce:
kde A1, A2 jsou zjištěné obsahy aminokyseliny při čase t1 a t2. Vzhledem k dlouhé době hydrolýzy byla v roce 1970 publikována metoda, ve které se bílkoviny hydrolyzují při teplotě 145 °C pouhé 4 hodiny.6 Porovnání klasické hydrolýzy při teplotě 110 °C po dobu 24 hodin a při teplotě 145 °C po dobu 4 hodin je ukázán v tabulce. Prakticky se kyselá hydrolýza provádí pod zpětným chladičem, ve speciálních ampulích, které jsou evakuovány a následně naplněny dusíkem, nebo v autoklávu. Všechny tři způsoby kyselé hydrolýzy byly porovnány s tím, že klasický způsob hydrolýzy pod chladičem a v ampulích jsou ve velmi dobré shodě, hydrolýza za zvýšeného tlaku při teplotě 145 °C po dobu 4 hodin poskytuje poněkud vyšší výsledky isoleucinu a valinu a nižší výsledky serinu a threoninu. Rychlý způsob hydrolýzy aminokyselin při teplotě 145 °C po dobu 4 hodin byl studován mezilaboratorní porovnávacím testem. Studie probíhala na 9 druzích matrice a relativní rozdíl je nižší než 5 %. Jako další hydrolyzační činidla se používají 4 mol/l methansulfonová kyselina po dobu 22-24 hodin při teplotě 115 °C,[8],[9],[10] 3 mol/l p-toluensulfonová[11] kyselina po dobu 22 hodin při teplotě 110 °C, 3 mol/l merkapoethansulfonová kyselina11 po dobu 22 při teplotě 110°C, směs kyseliny propionové a chlorovodíkové,[12] ale tyto způsob hydrolýzy se příliš neujaly.
Při kyselé hydrolýze dochází k destrukci sirných aminokyselin, zejména za přítomnosti cukrů. Tento problém nestability sirných aminokyselin byl vyřešen Shramem a spol.,[13] kteří před vlastní kyselou hydrolýzou oxidovali kyselinou permravenčí cystein a cystin na kyselinu cysteovou, methionin na methionisulfon, které jsou pak v kyselém prostředí již stabilní. Později tato metoda byla vylepšena a nadbytek kyseliny permravenčí byl rozložen kyselinou bromovodíkovou,[14] výtěžnost metody se pohybuje nad 90 %. Tento způsob hydrolýzy byl často modifikován, relativní směrodatná odchylka stanovení se pohybuje okolo 2,1 % pro methionin a 2,7 % pro cystin[15]. Mezilaboratorní směrodatná odchylka stanovení methioninu se pohybuje v rozmezí 1,18 do 12,8 % a pro cystein mezi 7,13 a 10,8 % v závislosti na analyzovaném materiálu[16].
Pro vzorky obsahují cukry se při stanovení tryptofanu používá alkalická hydrolýza, při níž se výtěžek tryptofanu snižuje přítomností vzdušného kyslíku, uvolňováním křemičitanů ze stěn hydrolyzačních nádob (zejména při použití hydroxidu sodného) a absorpcí tryptofanu na případných sraženinách a nerozpustných podílech reakční směsi. Z literatury lze soudit, že u vzorků s vysokým podílem nebílkovinných látek způsob hydrolýzy (reflux, hydrolýza v zatavené nádobě pod vakuem nebo dusíkem) významně neovlivňuje výsledky analýzy. Ostatní aminokyseliny se rovněž hydrolyzují, ale probíhá racemizace,[17] rozkládá se arginin, cystin a částečně lysin. Jako hydrolyzační činidlo se používá 4 mol/l hydroxid sodný, výtěžky tryptofanu jsou 100 ± 2 % za předpokladu dostatečné doby analýzy.[18] Vazba valin-tryptofan nebo isoleucin-tryptofan vyžaduje dobu analýzy až 98 hodin nebo 48 hodin při teplotě 135 °C. Z dalších činidel je možné uvést nasycený roztok hydroxidu barnatého prostého oxidu uhličitého při teplotě 110 °C po dobu 17-22 hodin za vakua. Po ukončení hydrolýzy se nadbytek hydroxidu barnatého odstraní vysrážením síranem barnatým kyselinou sírovou. Na sraženinách se může absorbovat část tryptofanu - až 4 % rel.18 K alkalické hydrolýze byl použit také 4 mol/l hydroxid lithný při teplotě 110 °C po dobu 23 hodin za vakua, po ukončení hydrolýzy se obsah neutralizuje kyselinou chlorovodíkovou.[19] Při hydrolýza za použití hydroxidu lithného byla použit i mikrovlnný rozklad vzorku po dobu 50-60 minut.[20]
Analytická koncovka
V současné době se k separaci a kvantifikaci aminokyselin používá výhradně metod vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC) nebo střednětlaké kapalinové chromatografie na iontoměničích. K separaci aminokyselin se používá především ionexů, kterých k separaci bylo využito již před 40 lety[21] a v různých modifikacích se v automatických analyzátorech aminokyselin používají dodnes.[22],[23],[24],[25] Vlastní kvantifikace aminokyselin není možná bez předchozího kroku jejich derivatizace, zde derivatizace za kolonou chromatografického systému.
Při použití HPLC metody se ponejvíce využívá separace aminokyselin na reverzní fázi oktadecyl (C18). Vzhledem k rozdílným chemickým vlastnostem aminokyselin, které je nutno separovat se k jejich separaci používá výhradně binární nebo ternární gradientová eluce o různém složení mobilních fází. K detekci aminokyselin se používá různých činidel k derivatizaci před kolonou i za kolonou s použitím UV detekci i detekce fluorescenční. Předkolonová derivatizace aminokyselin je nejčastější derivatizací, postkolonová derivatizace se uplatnila pouze u OPA a fluorescaminu,[26],[27],[28] ale vlivem zařazení reaktoru za analytickou kolonou dochází k rozšiřování chromatografické zóny a snížení účinnosti separace a příliš se neujala.
Předkolonovou derivatizaci je možné uskutečnit manuálně nebo roboticky v robotech nebo robotických autosamplerech. Podle referencí se však robotické autosamplery neuplatnily z důvodu nedostatečného zamíchání reakční směsi a dosahují tak nízké reprodukovatelnosti. Robotická derivatizace byla odzkoušena na robotickém autosampleru SPARK Triathlon, kde výrobce uvádí RSD derivatizační reakce 2% (derivatizace aminokyselin činidlem OPA), v laboratoři však byla dosažena hodnota asi 8 % (odzkoušeno na derivatizaci aminokyselin činidlem FMOC-Cl). Tento problém lze obejít použitím interních standardů, které se používají z následujících důvodů:
· interní standard kompenzuje nižší výtěžky derivatizační reakce
· kompenzuje ztráty při přípravě vzorku (rozklad aminokyselin, objemové korekce při ředění vzorku)
· kompenzuje variabilní objem při nástřiku vzorku.
Jako vnitřní standardy při stanovení aminokyselin se používají: norleucin, norvalin, a-aminomáselná kyselina, b-aminomáselná kyselina, g-aminomáselná kyselina a homoserin, mohocystin, ethanolamin aj.
Derivatizační činidla
9-fluorenyl-methyloxycarbonyl chlorid (FMOC-Cl)
AQC (6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamát)
Reakce o-phthaldialdehydu za přítomnosti merkaptoethanolu s primárními aminokyselinami probíhá podle schématu, reakce je poměrně rychlá, probíhá za laboratorní teploty, ukázalo se však, že stabilita 1-alkylthio-2-alkylisoindolového produktu není vždy dostatečná, neboť dochází často ke spontánním přesmykům.[29] Proto se reakce uplatňuje častěji při derivatizaci za kolonou,[30],[31],[32] ale našla uplatnění i přípravě derivátů před chromatografickou separací.[33],[34],[35],[36] Výhodou o-phthaldialdehydu je, že sám nefluoreskuje, ale samotné deriváty s aminokyselinami mají vynikající fluorescenční výtěžky; excitační maxima derivátů se pohybují okolo 340 nm, emisní maxima se pohybují okolo 450 nm. Nevýhodou o-phthaldialdehydu je, že reaguje pouze s primárními aminokyselinami a sekundární aminokyseliny jako prolin a hydroxyprolin tuto reakci neposkytují. Tento problém se obchází tak, že oxidací prolinu resp. hydroxyprolinu chlornanem sodným vzniká meziprodukt, který reaguje s o-phthaldialdehydem.31 Této reakce se pak využívá i při postkolonové derivatizaci aminokyselin o-phthaldialdehydem, kdy sekundární aminokyseliny reagují s chlornanem (za tepla) a následně jsou derivatizovány o-phthaldialdehydem.[37],[38] Chromatogram.
Sirné aminokyseliny cystein a cystin poskytují s o-phthaldialdehydem isoindolové deriváty, ale jejich fluorescenční výtěžek je velmi nízký,31 nedochází ke kompletní konverzi nebo vzniklý produkt není dostatečně specifický. Proto se musí před vlastní derivatizací cyst(e)in oxidovat kyselinou permravenčí[39],[40] na kyselinu cysteovou, která ochotně reaguje s o-phthaldialdehydem a poskytuje isoindolové deriváty, jejichž fluorescenční výtěžek je srovnatelný s ostatními aminokyselinami, nebo se blokuje thiolová skupina v molekule cyst(e)inu. Z důvodu ztrát a špatné reprodukovatelnosti při oxidaci těchto sirných aminokyselin se u cysteinu a jeho dimeru cystinu nejčastěji uplatňují alternativní metody blokace thiolové skupiny. Jedním z možných kroků je reakce cyst(e)inu s 3,3´-dithiopropionovou kyselinou na stabilní meziprodukt S-2-Carboxyethylthio-L-cystein, který již ochotně reaguje s o-phthaldialdehydem[41] a následně reaguje o-phthaldialdehyd s S-2-Carboxyethylthio-L-cysteinem (Cys-MPA) na stabilní isoindolový produkt. Jednouchá metoda byla publikována v roce 1982[42] a je založena na reakci kyseliny jodoctové s cysteinem za vzniku derivátu cysteinu, ve kterém je blokována thiolová skupina. Další zajímavé informace naleznete zde.
9-fluorenyl-methyloxycarbonyl chlorid (FMOC-Cl)
9-Fluorenyl-methyloxycarbonyl chlorid (FMOC-Cl) reaguje jak s primárními tak sekundárními aminokyselinami podle schématu za vzniku fluoreskujících derivátů s excitačním maximem při 263 nm a emisním maximem 313 nm a používá se výhradně k derivatizaci před kolonou.[43] Nevýhodou FMOC-Cl je, že se používá ve velkém nadbytku, který musí být odstraněn v následném extrakčním kroku pentanem[44],[45] nebo musí být nadbytek odstraněn reakcí s hydrofóbními (nepolárními) aminy jako např. adamantamin nebo octylamin.[46],[47] Je fakt, že při použití pentanu jako extrakčního činidla v několikastupňové extrakci nadbytku činidla zavádí další chyby, prodlužuje se doba analýzy a snižuje se reprodukovatelnost metody. Naproti tomu odstranění nadbytku činidla nepolárními aminy zavádí do derivatizační procedury jediný krok navíc a neprodlužuje podstatně dobu analýzy. Poněkud problematická je reakce histidinu, který může poskytovat mono- nebo disubstituované deriváty. Reakce 9-Fluorenyl-methyloxycarbonyl chloridu s aminokyselinami se provádí v prostředí acetonu a může docházet ke srážení derivátů hydrofóbních aminokyselin a proto se reakce může také provádět v prostředí acetonitrilu, kde je rozpustnost těchto derivátů vyšší. K odstranění nadbytku činidla byl použit rovněž alkalický hydroxylamin, který rovněž vlivem pH je promotorem konverze disubstituoavaného di-FMOC-histidinu a di-FMOC-tyrosinu a monosubstituované deriváty. Monosubstituované deriváty mon-FMOC-His a mon- FMOC-Tyr poskytují 2,5 krát vyšší odezvu a jejich píky jsou symetrické.[48] Při separaci aminokyselin dochází k jejich separaci na základní linii, kritické píky pro separaci jsou následující: Ile/Leu a dochází k „putování“ píku argininu (viz chromatogram).
Ninhydrin
Ve většině z ranných prací se modifikovala základní metoda Moorea a Steina, ve které byly aminokyseliny separovány na ionexové koloně s postkolonovou derivatizací ninhydrinem.[49],[50] Reakční mechanismus ninhydrinu s aminokyselinami je poměrně složitý a je znázorněn na schématu. Molekula aminokyseliny reaguje a dvěma molekulami ninhydrinu za vzniku tzv. Ruhemannova purpuru jehož maximum absorbance je při 570 nm.[51],[52],[53],[54],[55] Sekundární aminokyseliny jako prolin a hydroxyprolin poskytují poněkud odlišný komplex s maximem absorbance při 440 nm (R=H - prolin, R=OH - hydroxyprolin).[56],[57] Protože je reakce ninhydrinu při laboratorní teplotě velmi pomalá, probíhá reakce při teplotě 100-135 oC po dobu 1-2 minuty. Mez stanovitelnosti se pohybuje od 0,05 do 3 mmol v závislosti na druhu aminokyseliny, směrodatná odchylka stanovení do 2-3 %. Výhodou této metody je její velká robustnost, nevýhodou poněkud vyšší mez stanovitelnosti proti metodám HPLC a delší doba analýzy, která se pohybuje od 60 do 120 minut.
Dansylchlorid
Použití dansylchloridu je jedno z nejstarších předkolonových derivatizačních technik vůbec. Dansylchlorid reaguje jak s primárními tak sekundárními aminokyselinami podle schématu za vzniku derivátů s absorpčním maximem při 298 nm nebo se může používat fluorescenční detekce s excitačním maximem od 340 do 380 nm a emisním maximem od 470 do 530 nm a používá se výhradně k derivatizaci před kolonou. Největší nedostatek je velmi dlouhý reakční čas (2 až 60 minut), vysoké reakční teplota (60 až 100 oC) a tvorba multiderivátů u bazických aminokyselin. Wiedermeier a spolupracovníci minimalizovali vznik multiderivátů při reakci za laboratorní teploty při pH 8,5.[58] Výhodou je naopak jednoduchý derivatizační krok a celý může být proveden ve velmi krátkém čase a deriváty jsou stabilní až dva týdny při teplotě 4 oC,[59] chromatografická separace je naopak složitější zejména při separaci isoleucinu a leucinu.[60]
AQC (6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamát)
6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamát (AQC) je jedno z nejnovějších derivatizačních činidel vůbec.[61] AQC reaguje jak s primárními tak sekundárními aminokyselinami v prostředí 0,2 mol/l borátového pufru pH 9,3 při teplotě 55 oC po dobu 10 minut podle schématu za vzniku derivátů s excitačním maximem 245 nm a emisním maximem 395 nm a tyto deriváty jsou snadno separovány gradientovou elucí při teplotě 35 oC na reverzní fázi (C18, 150x3,9 mm). Při separaci aminokyselin dochází k jejich separaci na základní linii, kritické píky pro separaci jsou následující: Arg/Thr, Cys/Tyr, Val/Met a Ile/Leu. Reakce obvykle probíhá pro aminy a aminokyseliny za laboratorní teploty, tyrosin však poskytuje minoritní pobočné deriváty, které za laboratorní teploty pomalu přesmykují na majoritní monoderivát. Nadbytek činidla se likviduje hydrolýzou samotného činidla za vzniku majoritního, málo interferujícího 6-aminochinolinu a N-hydroxysuccinimidu, který neinterferuje vůbec. Samotné deriváty jsou stabilní asi týden při laboratorní teplotě. Chromatogram.
Phenylisothiokyanát (PITC)
Phenylisothiokyanát (PITC) se používá výhradně pro předkolonovou derivatizaci a následnou separaci derivátu aminokyselin jako phenylthiocarbamylu (PTC) aminokyselin na reverzní fázi s gradientovou elucí s detekcí UV při 254 nm, i když absorbční maxima derivátů jsou 269 nm.[62],[63] Schéma ilustruje chemismus derivatizační reakce - ta probíhá ve dvou stupních až na thiohydantoiny, které vznikají cyklizací phenylthiocarbamylu aminokyseliny. Detailní popis metody podal Bidlingmeyer a spol.[64] Nevýhodou je, že samotné činidlo reaguje s interferujícími látkami (reziduální kyseliny) ve vzorku a ty dávají interferující píky na chromatogramu (matrix effect). Proto se musí vzorek dvakrát odpařovat k suchu a to před přídavkem činidla a následně po reakci se nadbytek činidla odstraňuje za vysokého vakua vysušením přes noc nad pevným NaOH. Stabilita derivátu je funkcí teploty a času. Za laboratorní teploty je maximální stabilita při pH 5,0-7,5. Derivatizovaný vzorek může být uskladněn při teplotě - 20 oC až 1 týden, za obyčejné teploty dochází k jejich degradaci (<2 % za hodinu) zejména u derivátů cystinu, valinu, isoloeucinu a kyseliny glutamové. Chromatogram.
Porovnání jednotlivých derivatizačních činidel je uvedeno v tabulce č. 1.
Tabulka č. 1 Porovnání vlastností jednotlivých derivatizačních činidel používaných k derivatizaci aminokyselin
|
Charakteristika |
OPA |
FMOC-Cl |
Ninhydrin |
Dns-Cl |
AQC |
PITC |
|
Detekce |
FLD |
FLD |
UV |
UV (FLD) |
FLD |
UV |
|
Citlivost |
fmol |
fmol |
mmol |
pmol (nmol) |
fmol |
pmol |
|
Stabilita derivátu |
špatná |
dobrá |
-- |
dobrá |
dobrá |
střední |
|
Rychlost derivatizace |
rychlá |
rychlá |
malá |
malá |
rychlá |
střední |
|
Sekundární aminokyseliny |
ne |
ano |
ano |
ano |
ano |
ano |
|
Interference reagentu |
ne |
ano |
ne |
ano |
ano |
ano |
|
Interference matrice |
malý |
střední |
ne |
malý |
ne |
vysoký |
Vysvětlivky: FLD - fluorescenční detekce, další vysvětlení v textu
Komerčně vyráběné kity
|
Separační systém |
Instrumentace (Firma) |
|
Ionex/postkolonová derivatizace |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
RP-HPLC/předkolonová derivatizace |
|
|
|
|
|
|
Závěr
Z uvedeného přehledu je zřejmé, že problematika stanovení aminokyselin v krmivech není jednoduchá, je časově a experimentálně náročná a náročná co do přístrojového vybavení laboratoře. Svou nespornou úlohu hraje i hledisko zkušenosti operátora. Hledáme-li zdroje chyb stanovení aminokyselin v krmivech, můžeme je rozdělit zhruba do dvou skupin - příprava hydrolyzátu aminokyselin a vlastní analytická koncovka, která může zahrnovat další chyby kvantifikace tj. separace a detekce aminokyselin. Při požadavcích na stanovení aminokyselin musíme mít na mysli, že při stanovení celého spektra aminokyselin se musí vzorek podrobit třem typům hydrolýzy s jednou či dvěma analytickými koncovkami (schéma stanovení aminokyselin v krmivech). Při výběru analytické koncovky stojíme před rozhodnutím, zda použít jednoúčelový analyzátor aminokyselin nebo víceúčelový HPLC. K přednostem automatických analyzátorů aminokyselin patří jednoduchá a levná příprava vzorků ve srovnání s jinými postupy, robustnost metody, nevýhodou je poněkud dlouhá doba analýzy. Univerzální HPLC v současné době vytlačuje analyzátory aminokyselin, právě pro své víceúčelové použití. Výhodou HPLC metod je zejména nižší mez stanovitelnosti a kratší doba analýzy, nevýhodou je poměrně náročná a drahá příprava vzorků, zejména experimentálně náročná předkolonová derivatizace volných aminokyselin.
Dalčí informace týkající se aminokyselin můžete nalézt na adresách 1, 2 nebo 3.
Literatura